疫苗DNA殘留對人體的潛在危害

對所使用的疫苗，我們zui關(guān)心的是疫苗的效果和其安全性。現(xiàn)在很多疫苗是細胞培養(yǎng)疫苗，比如重組（CHO細胞）乙肝疫苗，Vero細胞狂犬病疫苗等大多數(shù)疫苗都是用細胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)，而對疫苗的純化是關(guān)鍵問題，我們要盡可能的去除宿主細胞DNA和宿主蛋白。假若宿主細胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人體將會產(chǎn)生不可預料的后果。就以疫苗DNA殘留為例，疫苗DNA殘留可能造成插入突變﹑導致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，zui終造成疫苗使用者致癌。

疫苗DNA殘留的相關(guān)法規(guī)

由于有如此潛在的危險性，所以許多機構(gòu)對疫苗DNA殘留制定了相關(guān)標準，1986年世界衛(wèi)生組織規(guī)定用細胞系生產(chǎn)的疫苗DNA殘留不能超過100 pg /支 ，而在1998年世界衛(wèi)生組織認為細胞系生產(chǎn)的疫苗DNA殘留不能超過10 ng /支，而在1997年美國藥品食品衛(wèi)生監(jiān)督局規(guī)定在美國使用的細胞系疫苗DNA殘留不能超過10 pg /支，中國規(guī)定的細胞系疫苗DNA殘留不能超過100 pg /支。

所以在疫苗生產(chǎn)中要隨時對DNA殘留進行檢測，以便知道每個過程除掉DNA殘留的能力。在每一批產(chǎn)品中我們必須檢測DNA殘留，所以我們必須運用敏感且行之有效的對DNA殘留定量的檢測方法。通常規(guī)定每支疫苗DNA殘留不能超過100 pg，也就大約等同于17個甚至更少CHO細胞基因組DNA的含量，對如此微量的DNA殘留進行檢測，所用的技術(shù)方法就必須相當敏感和穩(wěn)定，現(xiàn)在對DNA殘留定量的方法主要有以下三種：
1、分子雜交技術(shù)檢測DNA殘留
2、基于DNA結(jié)合蛋白的方法（Threshold® immunoassay）檢測DNA殘留
3、實時定量PCR法檢測DNA殘留

分子雜交技術(shù)檢測DNA殘留的原理和方法

分子雜交分析的基本原理是基于DNA探針檢測變性而且固定在硝-酸纖維素膜上的宿主細胞DNA。這些探針可以不依賴宿主細胞DNA來制備，例如用隨機引物制備探針。探針上標記酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛標記核酸探針，操作方便、靈敏度高，已標記的探針在4℃貯存可達兩年之久，方便隨時應(yīng)用，所以現(xiàn)在常采用地高辛標記核酸探針，用光標記法將光敏Dig標記到探針上，制成光敏-Dig-核酸探針，再與固定在硝--酸膜上的靶核酸進行靶DNA分子雜交，使之與抗Dig-堿性磷酸酶結(jié)合，zui后可用不同的檢測方式進行檢測，發(fā)光檢測和顯色檢測均可，靈敏度可達10pg以下（表 1  三種DNA殘留檢測方法的比較）。

基于DNA結(jié)合蛋白的方法（Threshold® Immunoassay）檢測DNA殘留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析系統(tǒng)是基于兩種DNA序列非特異性蛋白，單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合蛋白（SSB）和抗ssDNA 的單抗。檢測的基本過程是當生物素—DNA單鏈結(jié)合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的單抗與變性的宿主細胞DNA結(jié)合zui終形成復合物，通過親合素將此復合物連接到生物素—硝--酸纖維素膜，在通過洗滌所有非特異性的被洗脫掉，zui后放于有尿素溶液的讀數(shù)儀，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 導致PH值發(fā)生變化，讀數(shù)儀根據(jù)PH值的變化換算成DNA的量，從而達到檢測DNA殘留含量的目的。

實時定量PCR法檢測DNA殘留的原理和方法

熒光定量PCR是基于PCR擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，產(chǎn)物的增加可以通過熒光信號指示，通過實時監(jiān)控PCR體系中的熒光信號，對樣本中初始模板進行定量分析。定量PCR可實時檢測產(chǎn)物量，通過加入已知濃度的標準樣品繪制標準曲線，然后根據(jù)待測樣品在標準曲線中的位置推算初始模板的濃度，從而達到檢測DNA殘留含量的目的。

三種檢測DNA殘留方法的比較

3種方法用來檢測疫苗DNA殘留都要對樣品進行相應(yīng)的處理，這對zui終的結(jié)果的準確性至關(guān)重要。而雜交相對對樣品DNA的損失小，而用Q-PCR需要提取樣品的DNA，損失較大。在我們選擇那種方法時我們要考慮它的穩(wěn)定性，敏感性，成本等以至找到*的性價比的方法（表 1），從表1 我們不難發(fā)現(xiàn)使用分子雜交的方法是一種比較可行經(jīng)濟實用的方法，目前國內(nèi)也主要是用此方法。

表 1  三種DNA殘留檢測方法的比較

羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒產(chǎn)品簡介

產(chǎn)品中文名稱：高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒II

羅氏應(yīng)用科學部（Roche Applied Science）是zui早致力于向用戶提供非放射標記技術(shù)的公司之一，讓更多的科研工作者們可以避免使用危險的放射性同位素。DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（第二代）是由羅氏公司研發(fā)，并且是在DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（*代）的基礎(chǔ)上優(yōu)化升級的，具有更高的準確性、更好的靈敏度、操作時間更短等特點。自1995年地高辛產(chǎn)品上市以來，盡管有定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，DIG系統(tǒng)仍然是非放射性高效標記—檢測技術(shù)的*，被廣泛地應(yīng)用各種膜雜交及原位雜交技術(shù)中。

高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒II 圖片

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羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II檢測原理

該產(chǎn)品是用地高辛（地高辛：英文名Digoxigenin，簡稱DIG；又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子）標記的DNA探針，應(yīng)用于分子雜交和隨后的化學發(fā)光檢測。檢測主要分三階段進行：1. DNA標記：根據(jù)隨機引物標記技術(shù)，生成DIG地高辛標記的DNA探針。 2. 雜交：按照標準雜交方法進行，將地高辛標記的DNA探針用于核酸點雜交，可選擇帶正電的尼龍膜或純硝--酸纖維素膜作為雜交膜。 3. 免疫學檢測：首先將標記有AP的地高辛抗體與雜交探針免疫結(jié)合；然后在477 nm波長下，通過檢測堿性磷酸酶與CSPD底物產(chǎn)生的化學發(fā)光反應(yīng)的數(shù)值，從而達到免疫檢測的目的。

羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II的顯著特點

★ Accurate and fast-----使用預混合的高效地高辛（DIG）標記的隨機引物可以縮短標記DNA探針的操作時間，提高標記物的產(chǎn)量。
★ Sensitive-----在人類DNA的復合物和植物基因組中，可以檢測到單個拷貝的基因。
★ Time-saving-----地高辛（DIG）標記的探針可以儲存一年以上，雜交液可以反復使用3～5次（具體要根據(jù)每次雜交過程中標記探針產(chǎn)生信號的強弱來確定）。

起福生物為您提供配套的產(chǎn)品

生物制品加工過程中培養(yǎng)物殘留的污染物（Bioprocess Contaminant, BC）ELISA檢測試劑盒

宿主細胞蛋白（Host Cell Protein, HCP）殘留檢測ELISA試劑盒

例如： Vero Cell HCP ELISA Kit
           CHO HCP ELISA Kit, 3G
           Pichia pastoris HCP ELISA Kit 
           E.coli HCP ELISA Kit
           Human Erythropoietin（EPO） Quantikine IVD ELISA Kit 

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           尼龍膜
           PVDF膜
           硝--酸纖維素膜
           魚精DNA
           蛋白酶K