支原體去除試劑：

細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。國內外研究表明，95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是zui常見的污染細胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。
支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。
組織細胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作；細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體zui突出的結構特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內酰胺類、萬古霉素等*不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。

支原體是一種大小介于細菌和病毒之間（zui小直徑0.2um）并獨立生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態(tài)呈高度多形性。可為圓形、絲狀或梨形。

支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。

支原體代謝需固醇類物質、部分種類需要精氨酸、O₂或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存（PH7.6—8.0），對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。

支原體污染細胞后。培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解。因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢。甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

為確定有無支原體污染可做如下檢測：

①相差顯微境檢測：將細胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察。支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。

②熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗。置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向細胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。

③電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡便快速。也可以利用透射電鏡。

④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高。但方法較為復雜

支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養(yǎng)中生長，營養(yǎng)要求比細菌高。

細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。在細胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達到63%，支原體感染發(fā)生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達，又不能通過可視法對其進行檢測，而且它對細胞的生長率影響較小，不易引起注意。國內外研究表明，95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是zui常見的污染細胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。
支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。

組織細胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作；細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體zui突出的結構特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內酰胺類、萬古霉素等*不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細胞，不會重新感染支原體。

紅霉素有效，而且不影響細胞生長。網友“smilewf”經驗是細胞剛開始被支原體污染，細胞生長極為緩慢，而且狀態(tài)不好，細胞之間及底部總有一些亮晶晶的顆粒狀物質，換液后好些，但過2天又會增多，培養(yǎng)液清亮，嚴重時象一層細沙鋪在瓶底。剛開始以為是消化過頭引起的細胞的碎片和細胞內的顆粒，后來發(fā)現(xiàn)與胰酶消化無關。使用紅霉素（就在醫(yī)院的門診購買，很便宜）后這種現(xiàn)象明顯好轉，背景干凈，細胞生長很快，狀態(tài)明顯好轉，但好像紅霉素不能**支原體感染，停藥后一段時間可以復發(fā)，但如果細胞很重要有沒有多余的細胞時可以考慮一試，我用后覺得效果不錯。

網友“zllxash”的經驗：支原體是細胞培養(yǎng)中zui常見的，干擾實驗結果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細胞仍在繼續(xù)使用。據(jù)查，目前各實驗室使用的二倍體細胞和傳代細胞中約有11%的細胞受到支原體污染。因此，對支原體污染應嚴加防范。

用卡那霉素預防支原體污染有效。

檢測方法：

1、相差顯微鏡檢測；2、低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察； 3、DNA熒光染色法；4、電鏡檢測；5、3-H胸腺嘧啶摻入法； 6、聚合酶鏈反映法； 7、免疫學方法； 8 、支原體的培養(yǎng)。

對于支原體污染的細胞，可以采取補救措施：

1、抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24-48小時，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時可能有效。推薦用量：慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。對于支原體污染抗生素應用，預防性應用比污染后使用好。

2、 加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點。將受支原體污染的細胞置于41度中作用5-10小時可以殺滅支原體。但由于41度對培養(yǎng)細胞本身也有較大的影響，故處理前，應先進行預試驗，確定出zui大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。

支原體菌株來源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原體,M.FermentaneATCC19989發(fā)酵支原體 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原體 ,M.HominisATCC23114人型支原體 ,M.OraleATCC23714口腔支原體 ,M.HyorhinisATCC29052豬鼻支原體。其共同引物序列來自16s和23s保守區(qū)域，外部引物為Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；內部引物為 Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。

ＰＣＲ反應體系和條件：10×緩沖液（10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明膠）、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的濃度為2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄ ＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蠟油覆蓋。反應溫度和時間為:94℃/2ｍｉｎ預變性、94℃/30ｓ變性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循環(huán)30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反應取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反應以第1次ＰＣＲ擴增產物為模板取1μＬ。

一種名為BM-Cyclin的化學試劑，除體外培養(yǎng)癌細胞中支原體污染具體方法：

1、選用抗支原體藥物（BM-Cyclin-1、2 ），磷酸緩沖液配制，溶液抽濾除菌，0～4℃保存。

2、細胞處理過程：細胞傳代同時加BM-Cyclin-1 10μg/ml，37℃培養(yǎng)3天；胰蛋白酶消化、傳代，加入BM-Cyclin-2 5μg/ml，37℃培養(yǎng)3天；繼續(xù)傳代追加BM-Cyclin-2 5μg/ml一次，培養(yǎng)2～4天（如細胞污染嚴重可重復上述處理過程）棄藥液，D-Hank’s液洗2次，胰蛋白酶消化傳代，進行常規(guī)培養(yǎng)。

3 、在細胞檢測或實驗前，再用常用量的5倍慶大霉素或卡那霉素作短時間處理，每天30～60分鐘。

支原體的污染是目前細胞實驗室比較普遍存在的問題，用藥物來殺滅支原體雖是一種重要措施，畢竟是一種補救方法，而且清除后，支原體仍可重新污染細胞。

因此，重要的還在于預防，如嚴格選用無支原體污染的牛血清，保持細胞培養(yǎng)間潔凈和嚴格無菌操作等。

網友“arlbor”把從網上和書上看到的一些資料與大家討論一下吧:

細胞株若受到細菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之污染時，會嚴重的影響實驗的結果。而細菌、真菌等之微生物污染時，較易自培養(yǎng)基等的外觀變化察覺。但是若受到支原體之污染時，細胞之外觀較無明顯變化，但是其污染會造成細胞之生長速率緩慢、細胞產生病變之型態(tài)改變等等變化。

各國細胞庫支原體污染的統(tǒng)計表，如下：
 

造成支原體高污染率的原因為：
　　1、支原體size 0.1~0.8 um，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um）
　　2、支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學顯微鏡可觀察到的特征變化
　　3、過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式
　　4、細胞流通間缺乏品管，造成實驗室間的相互污染
　　5、研究或操作人員忽略污染問題

而支原體污染了來源：
　　1、已受污染的細胞
　　2、操作人員的疏失
　　3、已受污染的培養(yǎng)基、血清
　　4、操作環(huán)境不良、實驗器具不潔等

由于支原體為人體口腔中之正常菌叢，實驗室之操作人員的污染亦可能為污染源，須十分注意。而萬一細胞已受支原體污染時，*的處理原則為將細胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細胞株。但是若是堅持要作去除支原體污染，有以下幾種方法，只不過結果會與原始的細胞特性有差異。

去除支原體污染：
　　1、抗生素處理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
　　2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
　　3、Anti-sera

預防與控制方面可從以下各點加強注意：
　　G 設備方面：
　　1、使用已作支原體測試ok之細胞株
　　2、于另一隔離之區(qū)域操作未知是否有支原體污染之細胞
　　3、使用不添加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞
　　G 檢測方面：定期以標準的支原體檢測方法檢測細胞、培養(yǎng)基、血清、ddH₂O有否被支原體污染。G 實驗操作人員之無菌觀念與無菌操作技術之要求。

有關支原體污染之問題與回答：

1. 應如何避免細胞污染？
　　細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原體。 主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。 嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。

2. 如果細胞發(fā)生微生物污染時， 應如何處理？
　　直接滅菌后丟棄之

3. 支原體 （mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
　　不能。 除極有經驗之專家外， 大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。

4. 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？
　　支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。

5. 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？
　　直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

支原體之檢測：

一、直接培養(yǎng)法
　　·  原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。
　　·  特點：是目前zui直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。
　　·  缺點：培養(yǎng)時間長，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來 （例如M. hyorhinis）。需同時培養(yǎng)支原體株作為正反應對照組，可能會造成污染。
　　·  材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth （Difco 0554-17-1） horse serum、15% yeast extract solution （autoclaved）、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管（autoclaved）、無菌培養(yǎng)皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內壁。）
　　·  培養(yǎng)基制備：基本配方為Difco PPLO broth（60%）, 馬血清（20%）, 15% yeast extreat solution （10%）, 10x stock solution （10%）。由于培養(yǎng)時間長，可加入penicillin（50u/ml）至10x stock solution或加入thallium acetate （1：2000）至培養(yǎng)基中以防止其它細菌污染。
　　·  10x stock solution （1 liter） ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
　　·  液體培養(yǎng)基 （1 liter） ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4℃，期限1個月。
　　·  固體培養(yǎng)基 （1 liter ）：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鐘。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻后，倒入60x50㎜之無菌培養(yǎng)皿中，5ml/培養(yǎng)皿。保存于4℃，期限1個月。

步驟：
　　·  取1 ml細胞培養(yǎng)液或0.2ml細胞懸浮液，接種于液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養(yǎng)一周及二周后，分別取0.1 ml液體培養(yǎng)液涂在agar plate上，將其倒放置于37℃厭氧箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至少3星期，持續(xù)觀察是否有支原體之菌落出現(xiàn)。
　　·  另取1 ml細胞培養(yǎng)液或0.2ml細胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37℃厭氧培養(yǎng)3星期，持續(xù)觀察是否支原體菌落出現(xiàn)。
　　·  另作正負反應對照組，正反應對照組為Acholeplasma laidlawii （ATCC 23206） 與M. arginini （ATCC 23838）。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養(yǎng)基。

結果判讀：
　　·  支原體生長較慢，所以先在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1~2周增殖后，再培養(yǎng)于agar plate上。需至少培養(yǎng)3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結果。
　　·  典型之支原體菌落類似荷包蛋（fried- egg like），乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態(tài)（slime）。
　　·  若要區(qū)分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一星期后再種入agar plate，若是細胞則不會生長。

DNA螢光染色法

·  原理︰利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會結合到DNA之Adenosine-Thymidine （A-T） rich區(qū)域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。

·  測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養(yǎng)液接種于指示細胞培養(yǎng)液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養(yǎng)指示細胞再作螢光染色。正負反應對照組亦可以接種于indicator cell內作為對照。

·  待測細胞亦可作直接測試，但需為吸附型細胞，培養(yǎng)后直接作螢光染色。有些細胞易有螢光背景，而干擾結果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟。

·  特點︰簡單、經濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟。可以偵測不易培養(yǎng)之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結果。

·  缺點：有時仍會有螢光背景，影響判讀。

材料︰

·  Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red （HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide （Hoechst No.33258, Sigma B-2883）、thimerosol （Sigma T-5125）、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide （Nunc 177380）或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內放置無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內，使用前過火滅菌﹚，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀察。

·  Indicator cells: Vero （African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013） or 3T6（mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070），細胞須先測試無污染。αMEM with 10%FBS （ medium for Vero cell）

配制試劑:

·  無菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。
　　·  Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至*溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。
　　·  Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。
　　·  mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。
　　·  固定溶液（fixative）︰冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配制。
步驟：
　　·  培養(yǎng)Vero細胞： Vero細胞可作長期培養(yǎng)或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養(yǎng)。測試前一周培養(yǎng)Vero細胞。
　　·  在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養(yǎng)于chamber slide中，每個well加入1ml細胞懸浮液，于37℃, 5％CO2培養(yǎng)。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。
　　·  接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基，1ml待測細胞培養(yǎng)液（可將細胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。
　　·  將測試樣品加入chamber slide內，培養(yǎng)5天后，進行Hoechst 33258的螢光染色觀察。
　　·  以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應對照組﹙或是已感染支原體之細胞培養(yǎng)液或冷凍細胞液﹚，負反應對照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基（ αMEM +10%FBS）。
DNA螢光染色檢測︰
　　·  取出培養(yǎng)5日之Vero細胞，吸除培養(yǎng)液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復上述之步驟，風干10分鐘。
　　·  于每個well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。
　　·  吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。
　　·  以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發(fā)光束（330～380 nm）之濾光鏡，觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產生。

結果判讀：

若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規(guī)則點狀物不同。其螢光可維持數(shù)星期。

圖例 （A）為negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。（為positive result : 在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。

Positive Result 在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。

污染測試--支原體 :

PCR方法原理：

利用具特殊專一性之primers，經由PCR反應來復制mycoplasma DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依m(xù)ycoplsma種類不同而不同，因此可依所復制之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測與鑒定。

特點：靈敏（e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample） 與快速（一天）。可偵測不易培養(yǎng)之mycoplasma （e.g. M. hyorhinis）。不需培養(yǎng)mycoplasma作為正反應對照組，避免可能之污染。

缺點︰PCR反應很靈敏，易有偽陽性結果。此方法尚在評估中，故結果僅作為參考和內部品管之一部份。

材料與設備：

ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.
　　提供1st stage primer mixture與2nd stage primer mixture
　　positive control DNA （A. laidlawii ; M. pirum）
　　PCR reagents :
　　Taq polymerase （ 5 U / ul ）
　　dNTP（ dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each ）
　　10x PCR buffer （with 1.5mM MgCl2）
　　25mM MgCl2
　　sterile ddH2O
　　Machine / Equipment：
　　PCR thermal cycler
　　agarose電泳設備
　　DNA電泳膠體觀察設備
　　無菌PCR反應管
　　無菌1.5 ml微量離心管
　　無菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans

方法：

此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1st stage PCR結束后，取其反應物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。

結果：使用UV light觀察，并照相記錄。

方法：

此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1st stage PCR結束后，取其反應物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。

結果：使用UV light觀察，并照相記錄。

方法再詳盡點:

3.1 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
　　3.1.1 測試樣品 （ 2 ul / each ）
　　3.1.1.1 直接取樣測試細胞之培養(yǎng)液。
　　3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA （ A. laidlawii ; M. pirum ）
　　3.1.1.3 Negative control : ddH2O
　　3.1.2 Reaction mixture （ 23 ul / each ）
　　3.1.2.1 10x PCR buffer （含1.5 mM MgCl2 ） 2.5 ul
　　3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul
　　3.1.2.3 dNTP （ 1.25 mM each ） 1.0 l
　　3.1.2.4 MgCl2 （ 25 mM ） 0.5 ul
　　3.1.2.5 Taq DNA polymerase （ 5 U/ul ） 0.1 ul
　　3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul
　　3.1.3 PCR program （ 1st PCR與2 nd PCR相同）：使用PCR thermal cycler
　　3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
　　3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
　　3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min
　　3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
　　3.1.3.5 重復3.1.3.2至3.1.3.4步驟30 cycles
　　3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
　　3.2 2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）
　　3.2.1 測試樣品：1st stage PCR product（1 ul / each）。
　　3.2.2 Reaction mixture （ 24 ul / each ）
　　3.3.2.1 10x PCR buffer （含1.5 mM MgCl2 ） 2.5 ul
　　3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul
　　3.3.2.3 dNTP （ 1.25 mM each ） 1.0 ul
　　3.3.2.4 MgCl2 （ 25 mM ） 0.5 ul
　　3.3.2.5 Taq DNA polymerase （ 5U/ul ） 0.1 ul
　　3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul
　　3.2.3 PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler

4.0 膠片電泳分析
　　4.1 膠片 （2.0%） 置備: 將2 g agarose溶于100 ml （ 1x ） TAE buffer。
　　4.2 電泳液：（1x） TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）
　　4.3 選擇100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul （ 25 ng/ul ）
　　4.4 取10 ul 2 nd stage PCR產物分析，各加入2 ul （ 6x ） loading dye。
　　4.5 進行電泳分離100V, 25 min。
　　4.6 膠片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr為致癌物質，請戴手套并小心操作）
　　4.7 結果：使用UV light觀察，并照相記錄。

Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. （ from ATCC mycoplasma detection kit）

Table 1 : Variations of restriction fragment lengths of the 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of commonly encountered species of mycoplasma. （from ATCC mycoplasma detection kit）
　　* No restriction site
　　** When a polyacrylamide gel is used for the resolution of amplified DNA products, a double-band product with one bp difference may be observed for M. hominis. This feature can serve as a good indicator for differentiated M. hominis from M. arginini, which only produces a single-band DNA product.

網友“zllxash”提供支原體污染的細胞在光學顯微鏡下的照片：如下

Protocol：Detection of Mycoplasma by Culture
　　1. Inoculate 2 agar plates with 0.1ml of test sample.
　　2. Inoculate 1 agar plate with 100cfu M. pneumoniae.
　　3. Inoculate 1 agar plate with 100cfu M. orale.
　　4. Leave 1 agar plate un-inoculated as a negative control.
　　5. Inoculate 1 broth with 0.2 ml of test sample.
　　6. Inoculate 1 broth with 100cfu M. pneumoniae.
　　7. Inoculate 1 broth with 100cfu M. orale.
　　8. Leave 1 agar plate un-inoculated as a negative control.
　　9. Incubate agar plates anaerobically for 14 days at 37°C using a gas jar with anaerobic gas
pak and catalyst.
　　10. Incubate broths aerobically for 14 days at 37°C.
　　11. Between 3 and 7 days and 10 and 14 days incubation, subculture 0.1 ml of test broth onto
an agar plate and incubate plate anaerobically as above.
　　12. Observe agar plates after 14 days incubation at x300 magnification using an inverted
microscope for the presence of mycoplasma colonies （see Figure 14）.

Criteria for a Valid Result
　　All positive control agar plates and broths show evidence of mycoplasma by typical colony
　　formation on agar plates and usually a colour change in broths.
　　All negative control agar plates and broths show no evidence of mycoplasma.

Criteria for a Positive Result
　　Test agar plates infected with mycoplasma show typical colony formation.

Criteria for a Negative Result
　　The test agar plates show no evidence of mycoplasma.

Notes
　　1. Mycoplasma colonies have a typical colony formation commonly described as “fried egg”
（See Figure 8） due to the opaque granular central zone of growth penetrating the agar
surrounded by a flat translucent peripheral zone on the surface. However in many cases
only the control zone will be visible.
　　2. Positive controls may be included at a concentration to give 100 colony-forming units.
These controls should obviously be handled in a laboratory remote from the main tissue
culture laboratory.
　　3. Control organisms （M. pneumoniae, and M. orale） are available from National Collection of
Type Cultures （UK）.
　　4. Mycoplasma pneumoniae is a potential pathogen and must be handled in a class II
microbiological safety cabinet operating to ACDP Category 2 Conditions.
　　5. This test procedure should be carried out in a microbiology laboratory away from the cell
culture laboratory.

All from<>------Sigma

原理：該法是通過PCR技術將支原體16srRNA基因特異性擴增，來檢測培養(yǎng)細胞中污染的支原體。PCR引物選自16sr RNA基因上的支原體特異片段，此片段與其他細菌的序列無交叉性雜交反應。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳，經溴乙啶（EB）染色后在紫外透射儀上進行檢測。

1）  16sr DNA引物用水稀釋至40umol/L。
　　（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
　　（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’

2）  PCR擴增

（1）  在冰浴中對各樣品制備PCR重要混合物，對每個樣品均加入：
　　10X PCR緩沖液 5.0ml
　　25mmol/L dNTPs 混合物 0.4ul
　　40umol/L 16sr DNA引物 每種引物1.0ul
　　40umol/L pBR322 DNA 引物 每種 2.0ul
　　pBR322 DNA 1pg/ml 2.0ul
　　DNA聚合酶（5U/ml） 0.2ul
　　三蒸水 35.4ul
　　總量 45ul

（2）  用無菌去離子水稀釋樣品為1:10，1:100。

（3）  于每個eppendorf管中加45ul PCR擴增混合物，每管中分別加入樣品原液及1:10，1:100稀釋液各5ul，操作均在冰浴中進行。

（4）  在每個eppendorf管中輕輕加入50ul無菌礦物油，覆蓋在液面上。如DNA擴增儀帶有有制式熱蓋，此步驟可省略。

（5）  將各管放入DNA擴增儀的孔槽內，并執(zhí)行以下循環(huán)指令：
　　①  950C 10min 一個循環(huán)
　　②  950C，30S→580C 1min→720C 1min, 共30個循環(huán)。
　　③  zui后720C 10min延長循環(huán)。

網友bearina的意見：

在光鏡下，可以看到細胞膜上吸附很多圓點，40*16倍下約有0.1mm，分布多集中于細胞核周圍和細胞邊緣，中間部位較少。嚴重的整個細胞都可以看到。消化時可以看到它們從細胞膜上游離出來，很多，還會動。培養(yǎng)基偏堿時會大量游離。感染后細胞生長變慢，凋亡率增加，正常培養(yǎng)時也會出現(xiàn)死亡。我認為是支原體污染造成的。建議培養(yǎng)細胞時，如發(fā)現(xiàn)細胞有異常，一定要高倍鏡下檢測。低倍鏡下一般看不出細胞的變化。

gaoyunhang認為zui主要是支原體污染的發(fā)現(xiàn),如果發(fā)生支原體污染,細胞營養(yǎng)液常常變黃,細胞生長變緩,部分細胞發(fā)生脫落等等。

如果發(fā)生了支原體污染,除非的確是極為重要的細胞,zui保險的方法是將被污染細胞扔掉。

所有的對支原體污染有效的藥物對細胞均有一定的毒副作用，建議不要采用。

細胞培養(yǎng)支原體感染

① 細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。國內外研究表明，95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是zui常見的污染細胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。

② 支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。

③ 組織細胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作；細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體zui突出的結構特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內酰胺類、萬古霉素等*不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細胞，不會重新感染支原體。

1、支原體肺炎的藥是紅霉素和四環(huán)素（副作用多，已少用）。所以用紅霉素是有道理的。但是，由于耐藥菌的泛濫，紅霉素耐藥菌非常多，所以有人發(fā)現(xiàn)紅霉素無效（當然可能根本不是支原體污染），要不可以試試四環(huán)素，用的人少，耐藥菌還是要少一些的，然而，紅霉素和四環(huán)素都是抑菌劑，所以不能斷根，這就是我下面要談的。

2、對支原體有效的殺菌劑還是氨基甙類，即使只有中度敏感。這里面就有一個問題，很多人又用慶大霉素又用卡那霉素，我不知道這是為什么？他為什么不再加上鏈霉素和妥布霉素？協(xié)同作用是由不同機制的藥物合用產生的，同一機制藥物的作用僅等同于增加其中某種藥物的劑量而已，有什么意義呢？所以我覺得用一種就夠了。慶大霉素不錯，但耐藥菌也常見，所以有時可能還是沒效果。丁胺卡那是這類藥中較少產生耐藥性的，可以試試嗎？

3、談談合用的問題。我推薦抑菌劑+殺菌劑：紅霉素/四環(huán)素+慶大霉素/丁胺卡那霉素，我個人認為四環(huán)素+丁卡可能zui為有效，因為相對而言，細菌對他們都教陌生、敏感。但是還不夠，請往下看。

4、誰都不敢保證這樣就萬事大吉了。里面有一小撮細菌可能還能頑強抗過去，它們的后代必將變異為耐藥菌。所以還應該加點其他的措施，因為這些細菌量畢竟少，消化后的懸浮細胞離心一下，細胞畢竟比支原體重，是不是可以分離出來？多次稀釋細胞并離心是否可以很大程度的減少支原體的數(shù)量呢？當然，前提是用了一到兩次抗生素細菌只有少量了。

5、再不行，復蘇吧。

　　我們實驗室所有細胞都有支原體污染，而且從上個學期以來越來越嚴重了。本來上個學期細胞生長還比較快，而實驗室負責細胞房管理和復蘇細胞、配培基的老師看了以后也總說沒關系，因此一直沒在這事上下工夫，細胞長得太糟我就用D-Hanks洗兩次，然后用酶消化后用滅菌的離心管洗細胞、1000rpm離心，三次，同時用D-Hanks洗兩次培養(yǎng)瓶，重新貼壁，似乎也有一點點效果。但這個學期要用的幾種細胞中有的過了兩個星期也長不起來，長起來的細胞周圍也有很多沙子樣的小黑點，全實驗室所有養(yǎng)了細胞的都說自己的細胞長得差，負責細胞房工作的老師復蘇了一次又一次，這方面的問題還是沒有人著手解決，我急了，查了支原體方面的文獻，有些文章比較麻煩，注射到小鼠體內來殺滅支原體，至少這在我們實驗室是不可能使用的方法；有些文章是聯(lián)合使用兩種抗生素來清除支原體，簡單方便，我就試了這種。

關于檢驗支原體污染，有PCR法、培養(yǎng)法、DNA熒光染色法，我選擇的是DNA熒光染色法，將冰醋酸和甲醇按1:3混合，固定細胞兩次，每次10分鐘，然后用1μg/ml的Hoechst33258染色20分鐘，紫外激發(fā)，確認了我的細胞中生長的都有支原體污染。于是我花1.5元買了環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）藥片，稀釋成50μg/ml，離心去除淀粉之類的不溶性輔料，加入培基中，稀釋成10μg/ml，跟正常培基一樣用法，打算處理12天后再用Hoechst33258染色驗證，對于污染嚴重的再用1μg/ml四環(huán)素處理3天。我前兩天試的，每種細胞分成兩瓶，一瓶用加ciprofloxacin的培基，一瓶不加，對比明顯，效果不錯，但要*消除還需要一些天。我向同學推薦了這個方法，有人說自己的培基前段時間已經加了青霉素，但好象沒有效果，支原體沒有細胞壁，這類干擾細胞壁合成的抗生素當然對其沒有效果；有的同學試了，細胞變得漂亮多了，原來牢牢貼在瓶壁上的黑點也去掉了。呵呵，俺的那些細胞現(xiàn)在是越長越標致了。下圖是支原體污染細胞的Hoechst33258染色結果。

細胞一旦污染支原體，留之又不能，棄之又可惜，所以總要想一些補救措施，現(xiàn)將我所知道的與各位交流一下。
　　1）化學藥物——在上面講了很多了
　　2）抗血清處理——特異性多抗
　　3）6－甲基嘌呤脫氧核敢（６-MPDR）有限稀釋法
　　4）激活巨噬細胞的應用——可在24孔板內每孔加入1ml飼養(yǎng)細胞20萬/ml，使形成巨噬細胞單層，再加入所培養(yǎng)的細胞。巨噬細胞培養(yǎng)基中加入四環(huán)素、紅霉素、tylosin或林可霉素等抗生素，可消除污染
　　5）克隆法——有限稀釋法，是將細胞稀釋接種96孔板中，使每孔接種一個細胞，挑取無污染的單個克隆，此法對污染較輕的細胞株有比較好的效果。
　　6）加熱法——利用軟瓊脂技術，50度加熱滅活細胞的支原體，再于37度1-3天培養(yǎng)，使瓊脂中的抗生素與支原體進一步作用。
　　7）小鼠體內傳代除去支原體污染——被支原體污染的特異性雜交瘤細胞可接種鼠腹腔中傳代，待長出腫瘤后取出接種小鼠，如此反復2-3次，可有效清除。這種方法在實際單抗制備雜交瘤污染時特別適用。