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答：Klentaq 是 Taq 的截短版本，缺少酶的 5'>3'-外切核酸酶結(jié)構(gòu)域。Klentaq 提高了保真度，并且比 Taq 更耐熱、更堅(jiān)固。Omni Klentaq 與 Klentaq 的保真度沒有受到影響。Cesium Klentaq 的保真度略高于 Klentaq。其余突變酶的保真度尚未*確定。
與*級商業(yè) Taq 相比，我們的突變酶的敏感性不會因犧牲其特殊的抑制抗性或冷敏感性特征而受到損害，并且允許從人類 DNA 中檢測單基因拷貝。對于高產(chǎn)量擴(kuò)增，Klentaq 酶通常需要比 Taq 更長的延伸時(shí)間，我們建議每個(gè) 1 kb DNA 靶標(biāo)延伸 3-4 分鐘。
答：“LA”代表“長而準(zhǔn)確”。LA 酶與校對器混合，并以更好的保真度執(zhí)行。此外，它們是長 DNA 靶標(biāo)的優(yōu)選酶，它們的表現(xiàn)異常出色。此外，它們通常更穩(wěn)健，因此短目標(biāo)擴(kuò)增也可以從中受益。
*關(guān)于長靶點(diǎn)的提示：對于純化的 DNA 模板，考慮酶濃度至少為 0.1 ul/1 kb 靶點(diǎn)/50-100 ul 反應(yīng)體積，并允許每 1 kb 靶點(diǎn)有 3-4 分鐘的延伸時(shí)間。對于粗制樣品，可能需要更多的酶，具體取決于抑制水平（強(qiáng)烈建議使用酶滴定法）。考慮包括我們的 PEC 增強(qiáng)劑。
答：我們的新型酶是 Taq DNA 聚合酶的突變體，經(jīng)過特別挑選，因?yàn)樗鼈儗V泛使用的強(qiáng)效 PCR 抑制劑具有高度抗性，例如全血、血清、血漿、尿液、腐殖酸、膽汁鹽、植物組織提取物、各種食品相關(guān)抑制劑、GITC、乙醇等。因此，這些酶可以在大多數(shù)商業(yè) Taq 產(chǎn)品無法執(zhí)行的水平上耐受 PCR 中的此類抑制劑。Taq 突變體的這一*功能允許對各種臨床、環(huán)境和法醫(yī)原始樣品進(jìn)行直接 PCR，從而跳過 DNA 提取步驟。我們的 PCR 增強(qiáng)劑雞尾酒 (PEC) 專為大多數(shù)抑制性粗制 PCR 樣品配制，可進(jìn)一步提高反應(yīng)對抑制劑的耐受性。此外，我們的一些 PEC 旨在幫助處理困難的、富含 GC 的目標(biāo)。
答：我們*的突變 Taq 酶選擇，對各種強(qiáng)效 PCR 抑制劑具有耐受性，連同我們的 PCR 增強(qiáng)劑，可實(shí)現(xiàn)各種直接 PCR 應(yīng)用，在許多情況下跳過 PCR 之前的 DNA 提取。酶/增強(qiáng)劑的選擇取決于抑制物質(zhì)的類型和濃度、qPCR 檢測的類型、熱啟動 PCR 依賴性、模板的 GC 含量和其他因素。請參閱表格“哪種酶適合我”和“哪種增強(qiáng)劑適合我”。
答：我們所有的酶都非常適合嵌入染料，例如 SYBR Green。實(shí)際上，它們對 SYBR Green 的抗性比野生型 Taq 高 2-3 倍（這種染料在 1X 以上濃度時(shí)對普通 Taq 的 PCR 有抑制作用），這使它們在 qPCR 中具有一定的優(yōu)勢，特別是在一些熒光淬滅的反應(yīng)中.
對于 TaqMan 檢測，我們只推薦我們的全長 Taq 突變體（OmniTaq 系列或 CesiumTaq），但不推薦 Klentaq 突變體，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈η懈?TaqMan 探針?biāo)璧?5'>3'- 核酸外切酶活性。
提示：對于復(fù)雜/抑制性 qPCR 樣品，全長 Taq 和 Klentaq 酶的 1:1 混合物可能比單獨(dú)使用全長酶效果更好。（Klentaqs 通常更堅(jiān)固，半量的全長 Taq 酶足以用于探針切割）。如果你想試試這個(gè)，兩個(gè)緩沖區(qū)也應(yīng)該以相同的比例混合。
注意：我們的酶的 LA 版本不是適合 TaqMan 檢測的，因?yàn)樗鼈兙哂行ζ骰钚浴?/span>
答：我們建議您選擇 Omni Klentaq、Omni Klentaq 2、OmniTaq 或 OmniTaq 3，必要時(shí)與 PEC 結(jié)合使用。我們強(qiáng)烈建議對此類粗樣品進(jìn)行酶滴定，因?yàn)楦嗟拿赣兄诟嗟难骸Ｕ堄涀。簶颖镜淖罴衙噶靠赡苓h(yuǎn)遠(yuǎn)超過純化 DNA 樣本的最佳酶量，過量的酶可能導(dǎo)致過度擴(kuò)增。通常推薦使用純化 DNA 的酶量減少 5-10 倍。如果更高量的酶（至少 1 ul/25 ul 反應(yīng)）不能令人滿意，您可以加入 PEC 增強(qiáng)劑以進(jìn)一步增強(qiáng)血液抵抗力。我們不建議您將 PEC 用于您的純化 DNA，除非目標(biāo)是富含 GC 且堅(jiān)韌的。
您也可以使用我們用這些酶配制的 5X PCR 試劑盒（提供方便，但限制了滴定酶的選擇）。
根據(jù)循環(huán)條件，我們建議您使用針對目標(biāo)優(yōu)化的 PCR 方案進(jìn)行兩個(gè)更改： A. 在 94-95 度下引入更長的初始加熱步驟，即 8-10 分鐘。在騎自行車之前，以及 B. 延長時(shí)間的兩倍或三倍。請注意：如果您使用 PEC 增強(qiáng)劑，請記住它可能會將您的最佳退火溫度降低幾度。
注意：在為您的應(yīng)用選擇合適的酶后，同樣的注意事項(xiàng)也適用于其他抑制性粗樣品。
答：是的，在協(xié)議中進(jìn)行了一些簡單的更改。我們的新型酶在 PCR 中可以抵抗高達(dá) 40% 的血液。因此，在血液的 qPCR 中，擴(kuò)增應(yīng)該沒問題（如果你想在瓊脂糖凝膠中運(yùn)行它們，你應(yīng)該看到預(yù)期的產(chǎn)品）。然而，qPCR 中擴(kuò)增產(chǎn)物的光學(xué)檢測的并發(fā)癥源于血紅素的熒光猝滅效應(yīng)。如果您使用 SYBR Green，解決此問題的方法是簡單地將輸入染料濃度提高到 20-30 X（對于 5-10% 的血液），甚至更高，具體取決于血液濃度。這將補(bǔ)償淬滅效應(yīng)，并減少背景。
如果您使用 TaqMan 檢測，同樣由于血液的淬滅作用，我們建議將熒光探針濃度提高到 400-500 nM，并且不超過 4-5% 的血液。
注意：如果您擴(kuò)增血清、血漿或其他非淬滅粗樣品，則無需更改這些方案。
答：有些 DNA 提取試劑盒不能*去除起始材料中的 PCR 抑制劑，例如血液或植物組織成分或腐植酸，甚至?xí)胍恍┮种苿缥⒘康谋椒印⒙确隆⒘蚯杷犭一蛞掖肌Ｔ谧屑?xì)滴定酶后，可以通過使用我們的 Taq 抑制劑抗性突變體來消除這個(gè)問題。（與粗制 PCR 樣品相比，這對我們的酶來說應(yīng)該是一項(xiàng)相對“容易”的工作，并且您必須確保您不會過量使用酶）。
答：我們的冷敏感酶，例如 Cesium Taq、Cesium Klentaq AC 和 Cesium Klentaq C，在低溫下表現(xiàn)出抑制的活性，而在 65 度以上時(shí)它們變得*活躍，因此在 PCR 中具有內(nèi)在的熱啟動性能。與涉及抗 Taq 抗體或酶化學(xué)修飾的熱啟動 Taq 配方不同，它們不需要對循環(huán)條件進(jìn)行任何更改。
答：一些 Taq 制造商提供的酶單位濃度是由傳統(tǒng) DNA 聚合酶活性測定法的略微修改版本確定的，該測定法是早期為非熱穩(wěn)定性 DNA 聚合酶開發(fā)的。該測定基于相對簡單和“容易”的反應(yīng)，僅測量核苷酸在 72 度下?lián)饺霂锌诘?DNA 中，不考慮 PCR 條件下重要的酶質(zhì)量，例如熱穩(wěn)定性和持續(xù)合成能力。因此，它本身不是 PCR 檢測，并且不提供實(shí)際的“PCR 單位”。因此，它可能無法顯示和預(yù)測 PCR 中真正的酶性能。因此，我們與其他制造商一樣，相信為每個(gè)反應(yīng)提供推薦的酶量對于最終用戶來說更加可靠和實(shí)用。
[實(shí)際上，這張表只有答案，沒有問題。]
Klentaq1 是 Taq DNA 聚合酶的 Klenow 片段類似物。它是已知的最熱穩(wěn)定的 Taq 形式，它沒有任何外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶，并且其晶體結(jié)構(gòu)是已知的 [4]。
LA PCR 是長而準(zhǔn)確的 PCR [1]。
根據(jù)美國 5,436,149，后綴 LA 表示已混入少量校對酶。
KlentaqLA (KTLA) 或 TaqLA 或 TthLA 是高溫下進(jìn)行長 DNA 延伸的最佳酶，例如引物定向誘變、長 PCR 或高保真 PCR，或用 PCR 產(chǎn)物引發(fā)（大引物）。（這些“酶”實(shí)際上是混合物，美國 5,436,149，由 Wayne Barnes 發(fā)明，現(xiàn)在由日本 Takara BIO, Inc. 所有）。
- 觀看此空間以了解我在保真度方面的改進(jìn)。
- TaqLA 由 Boehringer-Mannheim 出售為“Expand”，Takara Shuzo 出售為“ExTaq for LA PCR”，Life Technologies 出售為“Elongase”。
- Perkin Elmer 以“Tth XL”出售 TthLA，Clontech 以“Advantage Tth”出售 - Stratagene 的“TaqPlus”和“Taq Extender”也申請了美國 5,436,149。
“LA 技術(shù)”是將兩種耐熱酶混合在一起以獲得更長、更準(zhǔn)確（更高保真度）的 DNA 延伸的概念，通常用于 PCR。由 Wayne M. Barnes、美國 5,436,149 和國外同行發(fā)明。該現(xiàn)在歸 Takara Shuzo 所有
以下兩種推薦的緩沖液都假定您添加的 dNTP 和它們自己的（等摩爾）鎂。如果您要添加 250 uM 每個(gè) dNTP，請?zhí)砑宇~外的 1 mM 鎂（最終 3.5 mM）以實(shí)現(xiàn)此目的。
我們通過儲備 10 mM 每個(gè) dNTP、40 mM MgCl2（“10/40”）來做到這一點(diǎn)。然后，以下緩沖液將在 1X 時(shí)提供最佳的“過量”鎂。[您可能更愿意在下面添加額外的 10 mM MgCl2，然后添加不含 Mg
的 dNTP。] Tris-HCl 原液由 Trizma Base 和 HCl 制成，濃度為 1 M Tris。然而，在室溫下以 50 mM 在其他普通水中讀取 pH 值。
* Klentaq1、KlentaqLA 和 Taquenase 的 10xKLA 為
* 500 mM Tris-HCl pH 9.2；160 mM 硫酸銨；25 毫米氯化鎂；1% 吐溫 20。
* Taq 和 TaqLA 的 10xTLA 相同，但只有 7.5 mM MgCl2。
* 包括用于高 GC 目標(biāo)和多重 PCR 的最終 1.3 M 甜菜堿。還將加熱步驟減少到 92-93 度。C. [從參考修改。2 & 5]
我們的“基準(zhǔn)強(qiáng)度”Klentaq1、KTLA 和 TAQUENASE 相當(dāng)于 wt Taq 的活性，如果它們用于 2 kb 的擴(kuò)增。也就是說，0.1 ul 正好適合 50 ul 的反應(yīng)大小。（野生型）Taq 的其他供應(yīng)商將此稱為 5 單位/ul；我們稱其為“5 個(gè) 2kb-PCR 單元”/ul。更長的目標(biāo)需要更多的 Klentaq1，最大為 0.65 ul/50 ul（目標(biāo)大小為 35 kb；需要 KTLA 而不是 Klentaq1）。對于小于 2 kb 的目標(biāo)，需要更少的 Klentaq1（但 0.1 ul 仍然可以）。
對于 2 kb 以下的 PCR 目標(biāo)，如果延伸溫度降低到 60 度，則需要 1/2 的酶（TaqLA 或 KlentaqLA）。并且延伸時(shí)間有所增加（即從 5' 到 8' 或 10'）。
Klentaq1 適用于短 PCR、RAPD 等。對于循環(huán)測序，它非常出色，但與 Taquenase 相比，它現(xiàn)在是舊技術(shù)。
KlentaqLA 是否在其 PCR 產(chǎn)物上留下鈍端？部分是，部分不是。Klentaq1 確實(shí)添加了額外的 A。然而，要有效地做到這一點(diǎn)，需要一個(gè)額外的最后延長時(shí)間（20-30 分鐘）。混合物中的校對
酶預(yù)計(jì)會去除這個(gè)額外的 A。哪一個(gè)獲勝可能取決于您的 PCR 反應(yīng)在完成
循環(huán)后得到的確切處理。可能性是
：4度過夜。
灣。25度吃午飯。
C。68度的咖啡。
d。上述任何一項(xiàng)，然后在 25 度時(shí)打個(gè)電話。
e. 上述以外。
- 我是否完成了上述實(shí)驗(yàn)條件，然后檢查了
DNA 的末端？否。
- 我是否將我的產(chǎn)品克隆到平端載體中？是的，在 T4 DNA 聚合酶的鈍端連接過程中使用 1 mM 六氨合氯化鈷和 1 mM DTT。
- 我檢查過整個(gè)克隆位點(diǎn)的閱讀框嗎？不是通過測序。
- 我是否曾經(jīng)將 KlentaqLA 制造的閱讀框關(guān)鍵 PCR 產(chǎn)物克隆到 ORF 的鈍端？是的，根據(jù)編碼產(chǎn)物的酶活性，大約一半的克隆似乎沒有問題。
- 我用過 T 向量嗎？不。
我們有數(shù)據(jù)表明 Taquenase 是循環(huán)測序的最佳酶。它必須與 MnSO4（除了 MgCl2）一起使用以獲得最佳結(jié)果（Barnes，未發(fā)表）。不幸的是，由于和許可問題（見下文），您無法使用它。
1.25 M 甜菜堿（Sigma 編號 B-2629）也是一個(gè)不錯(cuò)的主意，可包含在循環(huán)測序反應(yīng)中 [Barnes，未發(fā)表]
“Taquenase”(tm)是兩種Taq突變體的組合。突變體 1 是 N 端缺失 Klentaq1（美國 5,436,149 和其他國家正在申請中。突變體 2 是由 Stan Tabor [3] 發(fā)現(xiàn)的 F667Y。F667Y 突變允許 ddNTP 減少 100 到 1000 倍才能正常工作。截至 3 月 25 日， 1997 年，這種突變被授予 Tabor & Richardson 并授權(quán)給 Amersham 的美國 5,614,365 涵蓋。因此，除非我們獲得 Amersham 的許可，否則我們無法提供這種酶，這是意料之中的。
我們認(rèn)為沒有涉及循環(huán)測序的（由 M. Craxton, MRC Cambridge, England 發(fā)明），也不是雙脫氧測序（由 Fred Sanger, MRC Cambridge, England 發(fā)明）
。ddNTP 的意思是“雙脫氧 NTPs”或“雙脫氧終止子”。
NTP是指三磷酸核苷，聚合酶的組成部分。它們可以是 ATP、GTP、CTP 或 UTP==TTP。對于 RNA，有時(shí)為了清楚起見會添加前綴 r，例如 rCTP。對于 DNA，通常會添加前綴 d，例如 dATP。
雙脫氧是指沒有 OH 基團(tuán)的兩個(gè)位置（2' 和 3' 位置）。
Perkin Elmer 最近將其熒光 ddNTP 的價(jià)格（通過降低濃度）提高了 1000 倍。
DYE-ddNTP 的意思是“DYE 終止劑”或 DYE-雙脫氧終止劑，它會變得很拗口。它們由 ABI 銷售，但它們最初是由 Dupont 發(fā)明的，可從其子公司 NEN 獲得，或即將推出。
DYE 是指熒光標(biāo)記，由測序儀上的激光束激活。
Klentaq1 是已知的穩(wěn)定的 Taq DNA 聚合酶形式，在 98 或 99 度的加熱步驟中通過 PCR 測試。Taquenase 保持這種熱穩(wěn)定性。由于 Thermo Sequenase 是含有 7 個(gè)額外氨基酸的 Taquenase，我們相信它也具有這種更高的熱穩(wěn)定性。
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