表面抗體可用于鑒定抗原特異性雜交瘤細胞

原始B細胞在其表面表達具有相同氨基酸序列和抗原特異性的抗體的多個拷貝。抗原刺激并分化為漿細胞后，通過RNA剪接和初級RNA轉錄物的加工將膜抗體轉化為分泌的抗體，以去除疏水性跨膜錨。但是，RNA剪接在雜交瘤細胞中可能是不完整的，這將促進選擇具有改變的結合特性的抗體。因此，我們使用免疫熒光染色來檢測活雜交瘤細胞質膜上的免疫球蛋白。所有測試的分泌抗體的雜交瘤細胞，包括分泌IgG 1，IgG 2a，IgG 2b，IgG 3，與不表達免疫球蛋白的FO骨髓瘤細胞相比，IgM和IgM抗體在其表面顯示中等至高水平的膜免疫球蛋白（圖2A）。膜免疫球蛋白對雜交瘤細胞的功能活性通過用生物素化的聚乙二醇（PEG）或β-葡萄糖醛酸苷酶標記Alexa Fluor 647-綴合的鏈霉親和素標記3.3（抗PEG）和7G8（抗β-葡萄糖醛酸糖苷酶）雜交瘤細胞來檢查。 。3.3雜交瘤細胞特異性結合PEG但不結合β-葡萄糖醛酸苷酶，而7G8雜交瘤細胞結合β-葡萄糖醛酸苷酶但不結合PEG（圖2B），表明膜免疫球蛋白顯示出預期的抗原結合特異性。為了研究基于表面免疫球蛋白抗原結合的雜交瘤細胞高通量FACS是否可行，將7G8（抗β-葡糖醛酸糖苷酶）和3.3（抗PEG）雜交瘤細胞（99：1比例）的混合物染色，生物素化的PEG，然后與Alexa Fluor 647偶聯的抗生蛋白鏈菌素孵育。可以清楚地區分兩個不同的細胞群，對應于輸入的7G8細胞和3.3個細胞的比例（圖2C，左圖）。收集結合PEG的雜交瘤細胞并培養5天。對擴增的雜交瘤細胞的分析表明它們可以結合PEG（圖2C，右圖），表明有效選擇了3.3種抗PEG雜交瘤細胞。我們得出結論，分泌抗體的雜交瘤細胞在其表面上顯示出足夠的功能性免疫球蛋白，以允許鑒定和分離抗原特異性雜交瘤細胞。

圖2.雜交瘤細胞上的膜免疫球蛋白分析。（A）在用山羊抗小鼠Ig和兔抗山羊FITC染色細胞后，通過流式細胞術檢測在雜交瘤和FO骨髓瘤細胞上的膜結合免疫球蛋白。（B）在流式細胞儀上用生物素化的PEG或β-葡糖醛酸糖苷酶抗原，然后用Alexa Fluor 647-綴合的鏈霉親和素，在3.3抗-PEG和抗β-葡糖醛酸糖苷酶7G8雜交瘤細胞上檢測膜免疫球蛋白的功能性抗原結合。（C）以0.5：1生物素-PEG和Alexa Fluor 647-綴合的鏈霉親和素對以99：1比例混合的7G8抗-β-葡萄糖醛酸苷酶和3.3抗-PEG雜交瘤細胞進行染色。用熒光激活的細胞分選儀收集結合生物素-PEG的雜交瘤細胞（左圖），培養5天，然后用生物素-PEG和Alexa Fluor 647-鏈霉親和素染色（右圖）。

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SHM的可控誘導

我們構建了組成型和誘導型載體，以允許在雜交瘤細胞中激活誘導的胞苷脫氨酶（AID）的可控表達。一旦鑒定出具有所需特征的抗體變體，就將這些載體設計為促進AID表達的終止。甲loxP位-flanked組成型表達盒（的pCMV-AID-loxP序列）（圖3A）被用于通過慢病毒感染穩定轉導3.3抗-PEG雜交瘤細胞，使3.3 / loxP位-aid細胞。如eGFP報告蛋白的熒光所示，AID在3.3 / loxP -AID細胞中表達（圖3B，左側面板）。為了測試是否可以“按需”停止AID的表達，通過DNA電穿孔將pLM-mCherry-P2A-Cre質粒轉移到3.3 / loxP -AID細胞中。如通過mCherry表達可見，約23％的細胞表達Cre重組酶，對應于顯示出降低的eGFP表達的細胞群（圖3B，中間圖），表明AID基因盒的缺失。可以通過FACS輕松分離eGFP陰性細胞（圖3B，右圖）。mCherry是瞬時表達的，因此在這些細胞中不再可檢測到。為了確認AID基因的CRE依賴性缺失，從3.3細胞，3.3 / loxP -AID細胞或分選的Cre感染的3.3 / loxP制備的總細胞裂解液通過SDS-PAGE分離-AID細胞，并使用抗HA抗體通過Western印跡上的C端血凝素（HA）表位標簽序列檢測AID。在3.3 / loxP -AID細胞中檢測到AID蛋白，但在Cre處理的3.3 / loxP -AID細胞中不存在AID蛋白（圖3C），這表明AID可以通過Cre重組酶介導的雜交瘤細胞缺失而穩定表達并有條件地沉默。

圖3. AID的可控制表達。（A）pCMV-AID- loxP載體的示意圖。CMV立即早期啟動子之后是小鼠激活誘導的胞苷脫氨酶（AID）基因，HA表位標簽，弗林蛋白酶/ 2A肽（F2A）雙順反子表達接頭和eGFP報告基因。AID盒兩側有兩個loxP模體，用于Cre重組酶介導的基因切除。（B）在穩定表達pCMV-AID- loxP（3.3 / loxP）的3.3雜交瘤細胞中的eGFP（y軸）和mCherry熒光（x軸）-AID細胞，左圖），以及通過DNA電穿孔用pLM-mCherry-P2A-Cre質粒瞬時轉染后（中圖），隨后對eGFP陰性細胞進行了熒光激活的細胞分選（右圖）。（C）將由3.3、3.3 / loxP -AID或經Cre處理的3.3 / loxP - AID細胞（經分選）制備的細胞裂解物免疫印跡以檢測AID或微管蛋白上的HA表位標簽，作為細胞上樣對照。（D）自動調節pTetOn-AID質粒由四環素應答元件（TRE）啟動子，AID基因，HA表位，弗林蛋白酶/ 2A肽（F2A）雙順反子表達接頭，eGFP報告基因，IRES元件和rtTA-V14反式激活劑。（E）以指示的強力霉素濃度誘導48h的3T3 / TetOn-AID成纖維細胞中eGFP報告基因的流式細胞術直方圖。（F）DsRed2s在AID的熱點基序內的核苷酸位置519處含有過早的終止密碼子。（G）在有（▲）或沒有（○）強力霉素的條件下培養用pDsRed2s轉導的3T3（■）或3T3 / TetOn-AID成纖維細胞，并通過FACS分析DsRed2的表達。顯示了表達紅色熒光（指示終止密碼子的突變）相對于時間的細胞分數。

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還構建了四環素誘導的AID表達盒（pTetOn-AID），作為AID表達可控誘導的替代方法。強力霉素可與rtTA-V14結合形成活性反式激活因子，從而在前饋環中啟動由pTRE啟動子驅動的DNA轉錄（圖3D）。16，17穩定感染與多西環素的濃度梯度孵育兩天顯示的eGFP報告的劑量依賴性誘導，對應于AID的誘導型表達的3T3 /堤-AID的細胞（圖3E）。為了檢查AID是否具有功能上足以誘導SHM的功能，將3T3或3T3 / TetOn-AID細胞穩定轉染了DsRed2基因，其中在RGYW / WRCY AID共有熱點的情況下，酪氨酸173突變為琥珀色終止密碼子主題（圖3F）。通過添加強力霉素而在SHM啟動后，僅在3T3 / TetOn-AID轉染子中檢測到18 DsRed2熒光（圖3G）。我們得出的結論是，這些AID表達盒允許AID的可控表達以誘導SHM。

模擬體外生發中心反應

我們在3.3抗PEG雜交瘤細胞中表達AID，以分離在低溫下以高親和力與PEG結合的抗PEG抗體。這是通過擴增3.3 / loxP -AID細胞以允許SHM，在冰上用熒光標記的抗原（PEG）染色細胞，選擇通過FACS結合多PEG的雜交瘤細胞以及將所選細胞擴增兩周以允許繼續進行而完成的SHM。初的選擇是使用長鏈多價PEG分子進行的，但在隨后的細胞分選中，PEG的長度和化合價逐漸降低。經過五輪連續的細胞擴增和分選后，將每輪分選后收集的雜交瘤細胞樣品用Alexa Fluor 647-PEG 5K染色并在流式細胞儀上進行分析（圖4A）。）。通過第五輪分選，與3.3 / loxP -AID雜交瘤細胞結合的Alexa Fluor 647-PEG 5K的平均熒光強度（MFI）為233，而親代3.3雜交瘤細胞的值為23.2，表明這些雜交瘤細胞表達具有增強的PEG親和力的抗體變體。在第五輪選擇后，通過3.3 / loxP -AID雜交瘤細胞的單細胞分選分離出的三個雜交瘤克隆（1E3、1E10和2B5）觀察到了相似的高PEG結合（圖4B）。對來自3.3個亞克隆的免疫球蛋白可變區基因的序列分析表明，所有三種抗體變體在V H的構架1（FR1）中均表現出共同的A23V突變鏈和VL鏈的CDR2中常見的N53K突變（圖4C）。此外，1E10和2B5抗體均在V L鏈的CDR2中具有A55P突變，而1E10抗體在V L鏈的CDR3中具有另一個突變S92T 。

圖4.通過模擬生發中心反應分離溫度依賴性抗PEG抗體。（A）將3.3 / loxP -AID雜交瘤細胞富集用于結合Alexa Fluor 647-PEG探針（y軸）的細胞。還使用Alexa Fluor 405偶聯的山羊抗小鼠IgG Fc抗體（x軸）檢測了表面免疫球蛋白。將細胞培養2周，然后每輪分選約3×10 7個細胞（S0-S5）。結果顯示熒光標記的PEG的結合對表面Ig的水平。（B）PEG-Alexa Fluor 647與三個雜交瘤克隆（1E3、1E10和2B5）的結合，這些克隆是在選擇的第5輪后從雜交瘤群體中分離出來的（S5）。（C1E3、1E10和2B5抗體與親本3.3抗體的免疫球蛋白V H（上圖）和V L（下圖）基因序列的氨基酸序列和比對。使用網站http://www.bioinf。。ｏｒｇ.uk/abysis根據Kabat編號系統61分配抗體框架區和CDR 。

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抗PEG抗體變體在低溫下選擇性結合PEG

我們評估了兩種3.3抗體變體（1E3和2B5）與包被在微量滴定板中的PEG（10000 Da）的溫度依賴性結合。2B5變體以比親本3.3抗體更大的表觀親和力結合PEG，而1E3在4°C時大約和3.3結合，但兩種變體抗體在25°C或37°C時都顯示出逐漸降低的與PEG的結合（圖5A） 。通過表面等離振子共振分析與PEG結合的抗體表明，在4°C下2B5和1E3與親本3.3抗體表現出相似的親和力，但在25°C下1E3和2B5對PEG的親和力降低了85和185倍分別與它們在4°C下的親和力進行比較（表1）。由于與PEG的結合力較弱，無法在37°C下確定1E3和2B5的親和力。對于涂在微量滴定板中的其他長度的PEG，觀察到了類似的1E3和2B5溫度選擇性識別（圖S1）。我們還觀察到，與親本3.3抗體相比，1E3和2B5顯示出長鏈PEG的結合增強，但與短PEG分子（即750 Da PEG）的結合降低。1E3和2B5抗體在高溫下并不是天生不穩定的，因為即使在37°C下孵育5 d后，它們仍保留了完整的結合活性（圖5B））。此外，通過差示掃描量熱法測定的1E3和2B5抗體的解鏈溫度（分別為73.6°C和74.2°C）實際上高于親本3.3抗體（70.8°C），表明1E8和2B5抗體熱穩定的（圖5C）。這些結果表明，AID誘導的1E3和2B5抗體的免疫球蛋白V區基因突變賦予4°C優先結合PEG的能力。

圖5.抗PEG抗體變體的溫度依賴性結合和穩定性。（A）在溫度下，將梯度濃度的純化的3.3、1E3或2B5抗體添加到涂有線性氨基PEG（分子量10,000 Da）的微孔板孔中。1小時后，洗滌孔，并通過添加HRP綴合的驢抗小鼠IgG Fc抗體，然后添加ABTS底物來確定抗體結合。顯示了三次測定的平均吸光度值（405 nm）。將Bars，SD（B）3.3（■），1E3（○）和2B5（▲）抗體在與CH 3 -PEG 5k -NH 2結合之前，于37°C孵育的時間。通過ELISA在4°C下測定96孔微量滴定板中的DNA含量。顯示了通過測量ELISA中50％的大反應確定的相對于零時抗體活性的不同時間的抗體活性。（n = 3）。棒，SD（C），如在PBS中以1℃/ min的加熱速率通過差示掃描量熱法所測量的，熱展開為3.3（黑線），1E3（綠色短虛線）和2B5（紅色長虛線）。

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CDR突變在溫度依賴性PEG結合中的作用

為了確定哪些突變負責抗體變體2B5的溫度依賴性結合，我們將2B5中的保守氨基酸突變（V H V23A和V L K53N）分別還原為親本3.3抗體中的相應氨基酸（圖6A）。V H V23還原為丙氨酸并不能消除2B5ΔV與PEG的溫度依賴性結合（圖6B）。相反，如在4℃，25℃和37℃下通過2B5ΔK與PEG的類似結合所觀察到的，用天冬酰胺置換VL K53消除了2B5ΔK與PEG的溫度選擇性結合（圖6B）。我們得出結論，V L K53突變負責2B5與PEG的溫度依賴性結合。

圖6. V L鏈K53負責2B5與PEG的溫度依賴性結合。（A）重組2B5或2B5，其中V H V23（2B5ΔV）或V LK53（2B5ΔK）被相應的氨基酸取代從哺乳動物細胞培養基中純化親本3.3抗體。（B）重組2B5（■），2B5ΔK（○的分級濃度）或2B5ΔV（●）抗體在溫度下添加到涂有線性氨基PEG的微孔板孔中。1小時后，洗滌孔，并通過添加HRP綴合的驢抗小鼠IgG Fc抗體，然后添加ABTS底物來確定抗體結合。顯示了三次測定的平均吸光度值（405 nm）。酒吧，SD。

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2B5結合可以被冠醚模擬的PEG結構

幾項研究報告說，PEG可以配成賴氨酸殘基，在蛋白質晶體表面形成冠狀醚樣結構。19 - 21因此，我們假設，2B5可識別構象PEG可以由冠醚來模擬（圖7A。 ）。實際上，在4℃下18-crown-6以劑量依賴的方式*阻斷了固定量的2B5與固定化的甲氧基-PEG 2k -NH 2的結合（圖7B，上圖）。相比之下，18-crown-6在親本3.3抗體與PEG結合方面的競爭相對較弱（圖7B，上面板）。18-crown-6不影響同種型匹配的抗β-葡萄糖醛酸苷酶控制抗體（7G8）與固定的β-葡萄糖醛酸苷酶的結合（圖7B，下圖），證明了競爭反應的特異性。我們進一步推斷出，如果18-crown-6模擬在4°C形成的PEG結構，那么2B5應該在所有溫度下都與結構明確的18-crown-6結合。因此，我們通過表面等離振子共振檢查了2B5與固定在CM5芯片上的2-氨基甲基-18-crown-6在三種不同溫度（4°C，25°C和37°C）下的結合。2B5在所有測試溫度下均與固定的18-crown-6結合，而3.3和7G8抗體分別與固定的18-crown-6結合或相對不結合（圖S2））。同樣地，我們在4°C，25°C和37°C下檢測到2B5與96孔ELISA板上包被的2-氨基甲基-18-crown-6的結合（圖7C）。我們得出的結論是2B5結合到PEG結構，該結構優先在4°C形成，并且可以被18-crown-6模仿。

圖7. 2B5可以結合冠醚結構。（A）18-crown-6，PEG400和2-氨基甲基-18-crown-6的化學結構的圖示。（B）將梯度濃度的18-crown-6在4°C與10μg/ mL 3.3（○），2B5（■）或7G8（●）抗體混合，然后添加到涂有氨基PEG的96孔板中2k -NH 2（上圖）或β-葡萄糖醛酸苷酶（下圖）。結果顯示抗體結合以大結合活性的百分比表示。（n = 3）。條形圖，SD（C）純化的3.3（○）的分級濃度），2B5（■）或7G8（●）抗體在涂有2-aminomethyl-18-crown-6的微孔板孔中于4°C，25°C或37°C孵育。4小時后，洗滌孔并通過加入生物素綴合的山羊抗小鼠IgG Fc抗體和鏈霉親和素-生物素化的過氧化物酶復合物，然后加入ABTS底物來確定抗體結合。顯示了三次測定的平均吸光度值（405 nm）。酒吧，SD。

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2B5抗體對PEG化納米顆粒的熱親和純化

我們進一步探討了是否可以將2B5抗PEG抗體用于PEG化化合物的輕度親和純化。將冷PBS（4°C）中的PEG-Qdots上樣到裝有瓊脂糖珠的柱子上，瓊脂糖珠的表面共價連接有3.3或2B5抗體（圖8A）。用冷PBS洗滌色譜柱后，用檸檬酸鹽緩沖液（pH = 3.0）或37°C PBS洗脫PEG-Qdot。3.3和2B5抗體均可在低溫下捕獲PEG-Qdot。用37°C PBS洗脫從2B5色譜柱中釋放PEG-Qdot，而從3.3色譜柱洗脫PEG-Qdots需要進行酸洗脫（圖8B）。這些結果表明，2B5可通過在4°C至37°C之間簡單地熱循環來溫和純化PEG化化合物。

圖8. PEG化化合物的輕度親和純化。（A）PEG-Qdot655的溫度依賴性親和純化的示意圖。（B）將氧化的3.3或2B5抗體固定在Hydrarazide樹脂上并裝填到柱中。將PEG-Qdot655送入色譜柱，然后用冷PBS（4°C）洗滌色譜柱，然后用37°C PBS或檸檬酸鹽緩沖液（pH = 3.0）洗脫。在IVIS 200光學成像系統（Xenogen）上檢測到PEG-Qdot655的熒光。

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抗體的原位分類開關重組

從IgM到生發中心其他抗體類別的抗體重鏈基因的CSR也取決于AID活性。22因此，我們檢查了AID的表達是否可以促進類轉換抗體的分離。pCMV-AID- loxP載體用于通過慢病毒感染穩定轉導AGP4和3D8雜交瘤細胞。AGP4雜交瘤細胞分泌與PEG結合的單克隆IgM，而3D8雜交瘤細胞分泌與小鼠B16F10黑色素瘤細胞表面表達的抗原結合的單克隆IgM。23，24將雜交瘤細胞培養4周，然后用熒光標記的PEG（AGP4雜交瘤細胞）和PE偶聯的山羊抗小鼠IgG（AGP4和3D8雜交瘤細胞）對活的雜交瘤細胞進行染色，然后通過FACS將單個陽性細胞分選到96孔培養板的各個孔。通過ELISA檢查了AGP4 / loxP- AID和3D8 / loxP- AID克隆的培養基中抗體的重鏈類型。如所期望的，在親代AGP4和3D8雜交瘤細胞的培養基中僅檢測到IgM抗體（圖9A和B）。相比之下，所有選定的AGP4 / loxP -AID和3D8 / loxP-AID雜交瘤克隆分泌了IgG抗體，證實了從IgM到IgG的類別轉換。AGP4和3D8類轉換抗體的同種型的進一步分析表明，它們都是IgG 3。如通過ELISA確定的，類別轉換的抗體保留了抗原結合活性（圖9C和D）。但是，對類別轉換的3D8抗體的重鏈可變區基因進行測序后，發現AID共有熱點中的氨基酸發生了變化（表S1），表明在CSR期間也發生了SHM。我們得出的結論是，模仿生發中心反應可以促進同時發生SHM的IgM向IgG抗體的快速轉化。

圖9.雜交瘤細胞中的快速重鏈類別轉換。（A）將AGP4 / loxP- AID細胞培養4周，然后通過將單個細胞的熒光激活細胞分選到96孔板的孔中來克隆對表面IgG染色呈陽性的細胞。顯示了來自親本AGP4細胞和十個AGP4 / loxP- AID克隆的培養基中抗體的重鏈類別。（B）通過將單個細胞的熒光激活細胞分選到96孔板的孔中來克隆顯示表面IgG的3D8 / loxP- AID細胞。顯示了來自親本3D8細胞和三個3D8 / loxP- AID克隆的培養基中抗體的重鏈類型。（C）通過ELISA在涂有PEG或對照β-葡萄糖醛酸苷酶抗原（n = 2）的平板中測定了來自十個所選AGP4 / loxP -AID克隆的培養基中AGP4 IgM或IgG抗體的平均結合率。Bars，SD（D）使用B16F10細胞作為抗原來源，通過FACS確定3D8，三個3D8 / loxP -AID克隆或對照AGP4雜交瘤細胞的培養基中抗體的結合。

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細胞系和試劑

FO骨髓瘤細胞（PTA-11450），51個BALB / 3T3小鼠成纖維細胞（CCL-163），CC49（抗TAG-72的IgG 1 mAb，HB-9459），L6（抗人L6抗原的IgG 2a mAb，HB-8677） ，BC3（抗人CD3ε鏈的IgG 2b mAb，HB-10166）和PEG-1-6（抗流感病毒的Cg -189 IgG 3 mAb）雜交瘤細胞購自美國典型培養物保藏中心。雜交瘤細胞系AGP4（針對聚乙二醇的IgM mAb），3.3和6–3（針對聚乙二醇的IgG 1 mAb），7G8（針對人β-葡糖醛酸糖苷酶的IgG 1mAb）和3D8（針對B16F10黑色素瘤的IgM mAb）得到開發。我們的實驗室，并進行了描述。24，52，賴明宗博士（中國科學院分子生物學研究所）友善提供了53枚人類293FT細胞。將所有細胞在Dulbecco氏補充有2.98克/ L HEPES，將2克/ L的NaHCO改進的Eagle培養基中培養3，10％胎牛血清（HyClone公司），100U / mL青霉素和100μg/ mL鏈霉素，在37℃下，在空氣中含5％CO2的加濕氣氛。甲氧基-PEG750-NH2，甲氧基-PEG1K-NH2，甲氧基-PEG2K-NH2，甲氧基-PEG3K-NH2羥基-PEG5K-NH2，甲氧基-PEG10K-NH2，甲氧基-PEG 20K -NH 2（750，1000，2000，3000，5000，10 000，20 000道爾頓，分別地），4-臂聚（環氧乙烷）10K -NH 2，2-氨基甲基-18-冠-6和18-crown-6購自Sigma-Aldrich。

DNA質粒構建

質粒pAS4w.1.Ppuro（圖S3）包含用于強力霉素誘導基因表達的四環素響應元件啟動子（TRE）（Tet-on系統），pLKO_AS3w.Ppuro（圖S4）和pLKO_AS3w.Pneo（圖。S5），其含有CMV早期增強子/雞β肌動蛋白（CAG）啟動子用于cDNA的基因表達，和pLKO_AS3w.Ppuro-EGFP（圖S6），其中包含一個EGFP基因，是慢病毒載體。這些質粒與pCMVΔR8.91包裝質粒54和pMD.G VSV-G包膜質粒55一起從國家RNAi核心實驗室（中國科學院基因組研究中心分子生物學研究所）獲得。為了生成可終止的鼠類AID（AID）表達系統，我們設計了一個loxP側翼為loxP -CMV-AID-HA-F2A-eGFP- loxP表達盒（pCMV-AID-loxP）。通過RT-PCR從BALB / c小鼠分離的脾細胞中克隆了HA標記的鼠激活誘導的脫氨酶（AID-HA）DNA的片段。為了監測AID-HA的表達，使用了基于弗林蛋白酶2A（F2A）56的雙順反子表達策略，將增強的綠色熒光蛋白（eGFP基因）連接到AID-HA基因的下游。從pLNCX-抗-PEG-eB7擴增含有HA標簽和eGFP基因的一部分的HA-F2A-eGFP片段。57還通過PCR從pLNCX-抗-PEG-eB7克隆了CMV啟動子。通過PCR從pLKO_AS3w.Ppuro-eGFP克隆了eGFP片段。然后通過組裝PCR從CMV，AID-HA和F2A-eGFP片段中創建CMV-AID-HA-F2A-eGFP盒，并插入pLKO_AS3w.Ppuro質粒中，其中CAG啟動子被CMV啟動子替換。為了引入loxP位點，將退火的寡核苷酸分別插入CMV啟動子上游的Spe I位點和eGFP下游的Pme I位點。將所得的質粒pCMV-AID-loxP與pMD.G和pCMVΔR8.91共轉染到293FT細胞中，以產生重組慢病毒，該慢病毒用于感染雜交瘤細胞以將AID基因引入基因組。

我們還構建了可誘導的AID表達載體。通過PCR從pRetroX-Tet-On Advanced（Clontech Laboratories，Inc.）擴增rtTA-M2，然后使用多點定向誘變58進行突變，以獲得rtTA-V14基因，該基因僅需10 ng / mL多西環素即可達到相似的效果在Tet-on系統中，當強力霉素為1000 ng / mL時，基因誘導水平為野生型rtTA。17通過組裝PCR產生了IRES-rtTA-V14片段。將Nhe I-Pme I消化的AID-HA-F2A-eGFP片段和IRES-rtTA-V14片段插入pAS4w.1.Ppuro，以創建pAS4w.1.Ppuro-AID-F2A-eGFP-IRES-rtTA-V14 ，表示為pTetOn-AID。

從pDsRed2（Clontech Laboratories，Inc。）擴增出編碼DsRed2基因的DNA的片段，并插入到pLKO_AS3w.Pneo中以產生pAS3w.Pneo-DsRed2。通過使用QuikChange TM定點誘變試劑盒（Stratagene）進行定點誘變，將琥珀終止密碼子引入核苷酸位置519 18的pAS3w.Pneo-DsRed2中，以產生pDsRed2s。

PEG和β-葡萄糖醛酸苷酶的生物素化

將溶于2 mg / mL DMSO的4arm-PEG 10K -NH 2，甲氧基-PEG 5K -NH 2和甲氧基-PEG 2K -NH 2（Laysan Bio，Arab，AL）與6倍（對于4arm-摩爾過量的EZ-link NHS-LC-生物素（Pierce）或AlexaFluor®647琥珀酰亞胺酯（PEG 10K -NH 2）或2倍（對于甲氧基-PEG 5K -NH 2和甲氧基-PEG 2K -NH 2）摩爾過量Invitrogen（在DMSO中）在室溫下放置2小時，以生產生物素化的4arm-PEG 10K或Alexa Fluor 647共軛的甲氧基-PEG 5K和甲氧基-PEG 2K， 分別。這些化合物在DDH的5倍體積稀釋2 O和透析（分子量截止?12個000-14 000道爾頓）相對于雙蒸水2 O操作除去游離EZ-鏈路NHS-LC-生物素或Alexa氟647。同樣，將人β-葡萄糖醛酸苷酶59以2 mg / mL的濃度溶于PBS（pH 8.0）中，然后在室溫下與20倍摩爾過量的EZ-link NHS-LC-生物素混合2小時，以產生生物素化的β-葡糖醛酸糖苷酶。加入十分之一體積的1M甘氨酸溶液以終止反應。將生物素化的β-葡萄糖醛酸苷酶對PBS進行透析，以除去游離的EZ-link NHS-LC-生物素，進行無菌過濾并保存在-80°C。

雜交瘤細胞膜結合免疫球蛋白的分析

小鼠免疫球蛋白在活雜交瘤細胞上的表面表達是通過用2μg/ mL山羊抗小鼠Ig（ICN Pharmaceuticals）或山羊抗大腸桿菌抗體（Abcam）對含有0.05％BSA的PBS進行陰性對照染色來測量的在4°C下放置1小時。將細胞用冷PBS洗滌3次，并用2μg/ mL FITC綴合的兔抗-（山羊IgG F（ab）' 2）抗體（ICN Pharmaceuticals）染色。3.3和7G8雜交瘤細胞也用生物素化的4arm-PEG 10K染色（0.5 nM）或生物素化的β-葡萄糖醛酸苷酶（5μg/ mL）在漢克平衡鹽溶液（HBSS），2％FBS中在4°C下放置30分鐘，然后用Alexa Fluor 647偶聯的抗生蛋白鏈菌素（2μg/ mL）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）在4°C下放置30分鐘。通過用冷PBS洗滌兩次除去未結合的探針。在BD™LSR II流式細胞儀（Becton Dickinson）上測量10 4個活細胞的表面熒光，并用Flowjo（Tree Star）進行分析。

慢病毒將AID基因轉導入雜交瘤細胞

通過使用45μLTransIT-LT1轉染試劑將7.5μgpCMV- AID-loxP或pTetOn-AID與6.75μgpCMVΔR8.91包裝質粒54和0.75μgpMD.G VSV-G包膜質粒55共轉染來包裝重組慢病毒顆粒。（Mirus Bio）在10厘米培養皿（90％融合度）中生長的293FT細胞中。48小時后，收集慢病毒顆粒，并通過在4°C下以50 000xg超速離心1.5小時進行濃縮。將慢病毒顆粒懸浮在含有5μg/ mL聚乙烯的培養基中，并通過0.45μm過濾器過濾。將雜交瘤細胞接種在6孔板中（1×10 5病毒感染前一天）。將含有慢病毒的培養基添加到細胞中，然后將其離心1.5 h（500xg，32°C）。在含有嘌呤霉素（5μg/ mL）的*培養基中選擇細胞，以產生穩定的3.3 / loxP -AID，AGP4 / loxP -AID或3D8 / loxP -AID細胞。

細胞中AID的條件表達

在存在或不存在強力霉素的情況下，通過在3.3 / loxP -AID和3T3 / TetOn-AID細胞中檢測eGFP報告基因，在BD™LSR II流式細胞儀（Becton Dickinson）上測量細胞中AID的相對表達水平。為了檢查是否可以停止AID表達，在電穿孔溶液（Mirus Bio）中用5μgpLM-CMV-mCherry-P2A-Cre 60 DNA（Addgene）轉染了3.3 / loxP -AID雜交瘤細胞（2.5×10 6個細胞）使用BTX電穿孔儀（275電壓，15毫秒脈沖長度）。將細胞在6孔板中培養48小時，然后在BD™LSR II流式細胞儀上分析eGFP和mCherry熒光。轉染pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre 3.3 / loxPDNA轉染后10天，在FACSAria細胞分選儀上分離出eGFP表達陰性的-AID細胞。要直接測量細胞中的AID蛋白水平，請使用5×10 6將3.3或3.3 / loxP-AID雜交瘤細胞在0.5 mL RIPA緩沖液（1％NP-40、150 mM NaCl，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，50 mM Tris，pH 8.0）中于4°C裂解1小時。通過12.5％還原SDS-PAGE分析澄清裂解物中的50μg總蛋白，將其轉移到硝酸纖維素紙上，并依次用針對HA表位標簽序列YPYDVPDYA（載體實驗室）或兔抗微管蛋白α的生物素化山羊抗HA抗體染色抗體（NeoMarkers），然后分別是抗生蛋白鏈菌素-HRP和山羊抗兔Ig-HRP（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。通過ECL檢測（Pierce）可視化條帶，并使用LAS-3000 Mini Fujifilm成像系統（FujiFilm）分析條帶。

SHM分析

用DsRed2s慢病毒感染3T3或3T3 / TetOn-AID細胞，以生成3T3 / DsRed2s或3T3 / TetOn-AID x DsRed2s細胞。在有或沒有500 ng / mL強力霉素的情況下培養細胞。在限定的時間收獲細胞并進行流式細胞術以測量DsRed2信號，該信號指示過早終止密碼子的突變以允許全長DsRed2蛋白的表達。計算DsRed2陽性細胞的百分比，并報告為回復體/ 10 6個細胞。

通過模擬生發中心反應分離抗PEG抗體變體

為了分離抗PEG抗體變體，將3×10 7 3.3 / loxP-AID細胞培養兩周，然后在HBSS，2％FBS中用生物素化的4arm-PEG 10K（100 pM，1×10 6細胞/ mL）染色在4°C孵育30分鐘，然后在4°C與5 mL的Alexa Fluor 647偶聯的抗生蛋白鏈菌素（2μg/ mL）和PE偶聯的山羊抗小鼠IgG Fc抗體（2μg/ mL）孵育30分鐘測量膜結合的免疫球蛋白水平。通過用冷PBS洗滌兩次除去未結合的探針。在FACSAria細胞分選儀上收集顯示高Alexa Fluor 647熒光的細胞（占總細胞的1％），并培養2周，然后再次分選細胞。PEG鏈的長度和PEG探針的分支從4arm-PEG 10K逐漸降低，線性PEG 5K和線性PEG 2K。5輪后，將單個3.3 / AID細胞收集到96孔板中，并通過將pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre瞬時轉染到雜交瘤克隆中來終止AID表達。

抗體生產與純化

在15 mL培養基（DMEM，5％FBS）中將2.5×10 7的所選3.3 / loxP -AID變異雜交瘤細胞（1E3和2B5）接種到CELLine CL 1000兩室生物反應器（INTEGRA Biosciences AG）中。每7天收獲含抗體的培養基，然后通過蛋白A Sepharose 4 Fast Flow色譜法（GE Healthcare）純化。收集的抗體針對PBS進行透析，并進行無菌過濾。抗體濃度通過雙辛可寧酸（BCA）蛋白測定法（Thermo Scientific）確定。

抗體2B5的定點誘變

通過RT-PCR從2B5雜交瘤cDNA中克隆了重組2B5抗體基因。2B5輕鏈和重鏈DNA通過pLNCX-抗PEG-eB7中的復合弗林蛋白酶2A雙順反子表達肽接頭連接。將經EcoR I-Pme I消化的2B5 IgG片段插入pAS3w.Ppuro中以產生pAS3w.Ppuro-2B5。V H V23A和V L的定點誘變K53N在50μL混合物中進行，混合物包含20 ng pAS3w.Ppuro-2B5模板DNA質粒，每個引物15 pmole，dNTPs 20 nmole，2 U Phusion高保真DNA聚合酶（Thermo Scientific）在1 x Phusion緩沖液中。熱循環在95°C進行0.5分鐘的初始變性; 在95°C下進行18個循環0.5分鐘，在55°C下進行1分鐘，在68°C下進行11分鐘。冷卻至≤37°C后，將2 U Dpn I限制酶（NEB）直接添加到37°C的擴增反應中1.5 h。通過熱激法，將四微升Dpn I消化的樣品用于轉化DH5α感受態細胞。通過慢病毒轉導產生穩定分泌2B5 / V23A（2B5ΔV）和2B5 / K53N（2B5ΔK）抗體的3T3細胞，并如上所述在嘌呤霉素（10μg/ mL）中進行選擇。

抗體ELISA

將Maxisorp 96孔微孔板（Nalge-Nunc International，Roskilde，丹麥）用0.5μg/孔的甲氧基-PEG 750 -NH 2，甲氧基-PEG 1K -NH 2甲氧基-PEG 2K -NH 2，甲氧基-PEG 3K-包被。 NH 2羥基-PEG 5K -NH 2，甲氧基-PEG 10K -NH 2，甲氧基-PEG 20K -NH 2或4臂聚環氧乙烷10K -NH 2（50μL/孔）0.1 M NaHCO 3 / Na 2一氧化碳3（用HCl調節至pH 8.0）緩沖液在37°C下放置3小時，然后在4°C下用200μL/孔稀釋緩沖液（PBS中5％脫脂奶）封閉過夜。將抗體在37°C下預孵育長達5 d，以檢查熱穩定性。將在50μL2％脫脂乳中的PBS中濃度分級的抗體在4°C，RT或37°C下添加1小時。將板分別用PBS在4℃，RT或37℃下洗滌3次。在4°C，RT或37°C下將50μL稀釋緩沖液中的HRP偶聯驢抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）加入1小時。如上所述洗滌板。為了進行競爭性ELISA分析，將maxisorp 96孔微孔板用0.5μg/孔的氨基PEG 2K -NH 2包被。或如上所述的人β-葡糖醛酸糖苷酶。制備了從120 mM開始的18-crown-6的3倍系列稀釋液，并與20μg/ mL的3.3、2B5或7G8抗體1：1（v / v）混合（因此抗體的終濃度為10μg / mL）。將混合物在4℃下添加到板中1小時。將板在4℃下用PBS洗滌3次，然后在4℃下與綴合有HRP的驢抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）一起溫育1小時。對于冠醚ELISA分析，如上所述，將maxisorp 96孔微孔板用0.5μmol/孔2-氨基甲基-18-crown-6包被。在4°C，25°C或37°C下，將50μL2％脫脂乳的PBS中的抗體（3.3、2B5或7G8）的分級濃度添加到板中4小時。將板分別用PBS在4℃，25℃或37℃下洗滌兩次。在4°C，25°C或37°C下將50μL稀釋緩沖液中的生物素偶聯山羊抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）添加1小時。如上所述在不同溫度下洗滌板。將5微克生物素化的過氧化物酶（Invitrogen）和10μg鏈霉親和素（Thermo Scientific）在室溫下于15 mL PBS中預孵育30分鐘，以允許形成復合物，然后將50μL加入孔中。未結合的抗體在4°C，25°C或37°C下用PBS洗滌四次。在所有情況下，通過加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-疊氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H 將5微克生物素化的過氧化物酶（Invitrogen）和10μg鏈霉親和素（Thermo Scientific）在室溫下于15 mL PBS中預孵育30分鐘，以允許形成復合物，然后將50μL加入孔中。未結合的抗體在4°C，25°C或37°C下用PBS洗滌四次。在所有情況下，通過加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-疊氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H 將5微克生物素化的過氧化物酶（Invitrogen）和10μg鏈霉親和素（Thermo Scientific）在室溫下于15 mL PBS中預孵育30分鐘，以允許形成復合物，然后將50μL加入孔中。未結合的抗體在4°C，25°C或37°C下用PBS洗滌四次。在所有情況下，通過加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-疊氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H在室溫下用2 O 2和100 mM檸檬酸磷酸酯（pH 4.0）處理30分鐘。在酶標儀（Molecular Device）中測量孔的吸光度（405nm）。

IgG的Fab片段化

將木瓜蛋白酶（Sigma-Aldrich）溶解在補充有20mM 1-半胱氨酸和20mM EDTA（PBS-Sigma）的PBS中的終濃度為0.1mg / mL，然后將pH調節至7.2。將等體積的純化的3.3、1E3或2B5抗PEG抗體（2 mg / mL）添加到木瓜蛋白酶溶液中，并在37°C下孵育2.5小時。加入十分之一體積的0.3M碘乙酰胺溶液（Sigma-Aldrich）以終止反應。通過在PEG親和柱上進行親和色譜純化3.3、1E3和2B5抗PEG Fab片段，方法是將1g CNBr活化的Sepharose 4B（GE Healthcare）在1 mM HCl（pH 3）中溶脹30分鐘，然后用偶聯緩沖液（0.1 M NaHCO 3，pH 8.3）并加入五摩爾甲氧基-PEG 30K-mL胺（Laysan Bio）/ mL凝膠在偶聯緩沖液中于25°C放置4 h。通過在25°C下向凝膠中添加1/10體積的1M Tris（pH 8），封閉CNBr活化的瓊脂糖凝膠上剩余的活性基團2小時。將PEG偶聯的Sepharose用含有0.5M NaCl的0.1M乙酸鹽緩沖液（pH 4）洗滌，然后用含有0.5M NaCl的0.1M Tris（pH 8）洗滌。將木瓜蛋白酶消化的抗體在4°C上樣到PEG-樹脂柱上45分鐘，并用冷PBS洗滌以去除木瓜蛋白酶和Fc片段。用100 mM甘氨酸緩沖液（pH 3）洗脫結合PEG-樹脂的抗PEG Fab片段，并用PBS透析。

雞蛋清溶菌酶的聚乙二醇化

三毫克/毫升雞蛋白溶菌酶（HEL）（Sigma-Aldrich公司）的PBS（pH8.0）中，用4倍摩爾過量的甲氧基PEG的混合2K在25 2小時-succinimidylpropionate（為Shearwater Polymers提供）℃至生產單聚乙二醇化的HEL（PEG 2k-HEL）。加入十分之一體積的1M甘氨酸溶液以終止反應。通過在Sephacryl S-300 HR柱上的凝膠過濾除去未反應的PEG。PEG 2k -HEL的濃度通過BCA測定（Thermo Scientific），以牛血清白蛋白作為參考蛋白來確定。

通過表面等離振子共振分析抗PEG抗體的結合動力學

在4℃，25℃和37℃下，在Biacore T-200（GE Healthcare）上測量3.3，1E3和2B5抗PEG Fab片段的結合動力學。通過使用標準程序通過EDC / NHS反應進行胺偶聯，將PEG 2k -HEL固定在CM5芯片（GE Healthcare）上。總共固定了57個共振單元（RUs）。在HEPES緩沖鹽水中以各種濃度的抗體以65μL/ min的恒定流速確定結合。

抗體的熱穩定性

將抗體在PBS中透析，脫氣，然后以0.5 mg / mL的濃度添加到差示掃描量熱儀（Nano DSC III）（TA Instruments）的樣品室中。將脫氣的PBS注入參比室。在將每個抗體-緩沖液對在3 atm的固定壓力下以每分鐘1°C的速率從10°C線性加熱到110°C時，監測差分功率。還使用與抗體樣品相同的步驟收集緩沖液（脫氣的PBS）掃描進行基線扣除。

通過表面等離振子共振將抗體與冠醚結合

在確定的溫度下，在Biacore T-200（GE Healthcare）上測量抗體對18-crown-6化合物的結合活性。通過使用標準程序通過EDC / NHS反應進行胺偶聯，將2-氨基甲基-18-皇冠-6固定在CM5芯片上。以10μL/ min的恒定流速將2-aminomethyl-18-crown-6（10 mM在50 mM硼酸鈉緩沖液中，pH 8.5）注射到EDC / NHS活化的CM5芯片中，持續30分鐘。通過注射乙醇胺使剩余的琥珀酰亞胺酯失活。總共固定了279.4個共振單位（RUs）。在4°C，25°C和37°C的HEPES緩沖鹽水中，以1μM的抗體以50μL/ min的恒定流速進行抗體結合分析。

通過抗PEG抗體親和純化PEG化的納米顆粒

通過在抗PEG抗體樹脂柱上的親和色譜法純化PEG-Qdot655納米顆粒。簡短地，將偶聯緩沖液（0.1 M乙酸鈉，0.15 M氯化鈉，pH 5.5）中的5 mg 3.3或2B5抗PEG抗體與10 mM偏高碘酸鈉（Thermo Scientific Pierce）在室溫下于黑暗中反應， 30分鐘。在Zeba™Spin脫鹽柱上除去偏高碘酸鈉，然后將氧化的抗體與1 mL含0.1 M苯胺的Ultradid Hydrazide樹脂（Thermo Scientific）在室溫下孵育4小時。將抗PEG樹脂填充到柱中，并用PBS洗滌3次。將500微升PEG-Qdot655溶液（在PBS中為32 nM）在4°C加載到3.3或2B5抗PEG色譜柱中。用冷PBS洗滌柱，并用37℃PBS或100mM檸檬酸鹽緩沖液（pH ＝ 3）洗脫結合的PEG-Qdot655納米顆粒。將顆粒轉移到Nunc F96 MicroWell黑色聚苯乙烯板（200μL/孔）中，并在IVIS 200光學成像系統（Xenogen）上檢測到PEG-Qdot655的熒光（激發/發射：450 nm / 660 nm）。

免疫球蛋白ELISA

將Maxisorp 96孔微孔板用0.5μg/孔的山羊抗小鼠IgG + IgA + IgM（Jackson ImmunoResearch Laboratories）包被在50μL/孔的0.1 M NaHCO 3 / Na 2 CO 3中（用HCl調節至pH 8.0）緩沖液在37°C下放置3小時，然后在200°L /孔的稀釋緩沖液（PBS中5％脫脂奶）中在4°C封閉過夜。將在50μL2％脫脂牛奶（1：100）中稀釋的雜交瘤上清液在室溫下加入板中1小時。將板用PBS洗滌3次。在室溫下將HRP偶聯的兔抗小鼠IgG，IgA或IgM（MP Biomedicals，2μg/ mL）加入50μL稀釋緩沖液中1小時。如上所述洗滌板。通過在室溫下添加150μL/孔ABTS溶液30分鐘來測量結合的過氧化物酶活性。在酶標儀中測量孔的吸光度（405 nm）。根據制造商的說明，使用Mouse MonoAb-ID試劑盒（Zymed Laboratories）確定類別轉換的AGP4和3D8抗體的同種型。

類轉換3D8抗體變體的FACS分析

將B16F10細胞在4°C下用3D8或3D8 / loxP-AID細胞的培養上清液染色30分鐘。將細胞用冷PBS洗滌3次，并用2μg/ mL PE-綴合的PE-抗山羊IgG Fc抗體（Jackson ImmunoResearch Laboratories）染色。通過用冷PBS洗滌兩次除去未結合的抗體。在BD™LSR II流式細胞儀上測量10 4個活細胞的表面熒光，并用Flowjo進行分析。