QuickZyme Biosciences是一家創新的生命科學公司，為研究界提供新穎*的產品，這些產品在基質相關蛋白，酶和測定法領域具有附加值。

上海起發Quickzyme QZBtotcol1現貨使用說明書

介紹

膠原是細胞外基質的主要成分之一。膠原生成的失調會導致纖維化（過多的膠原）或骨關節炎（過少的膠原）等病理變化。

因此，在許多情況下，膠原蛋白的測定是很重要的

疾病相關研究。

quickzyme總膠原測定是基于羥脯氨酸的檢測。羥脯氨酸是一種非蛋白性氨基酸，存在于哺乳動物的彈性蛋白和膠原蛋白中。它的存在主要局限于膠原的三螺旋，在那里它的存在增加了三螺旋的穩定性。羥脯氨酸是在脯氨酸羥化酶的作用下由特定的脯氨酸殘基翻譯后形成的。組織水解物中的羥脯氨酸可以直接測量膠原蛋白的含量。

膠原的測定是從組織樣品在95oC的6M HCl中*水解開始的。水解產物中的羥脯氨酸殘基通過對prockop和udenfriend（anal）所述方法的改進進行定量。Biochem.，1960，1:228-239）。該分析測量了樣品中羥脯氨酸的總量，它代表了樣品中存在的所有類型的膠原，而不區分膠原類型和前膠原、成熟膠原和膠原降解。

產品

該測定是簡單的，并且結果在570 nm處具有大的吸光度。這種分析方法的發展使得它不需要酸水解后的干燥步驟，而酸水解通常需要特殊的設備。

Total Collagen Assay

總膠原測定

總膠原蛋白測定試劑盒基于對膠原蛋白進行酸水解而獲得的羥脯氨酸殘留的定量比色測定。通常，對于該分析，需要水解除去HCl，這是一個耗時的步驟，并且/或者需要特殊的設備。QuickZyme總膠原蛋白測定法是僅有不需要此繁瑣步驟的基于羥脯氨酸的測定法，可在水解步驟后進行快速（<2小時）且簡便（96孔板形式）的測定。

膠原蛋白測定總規格

• 定量測量所有類型的膠原蛋白，種類無關。
• 樣品：細胞提取物，組織勻漿，組織。
• 比色法測定羥脯氨酸含量
• 范圍：6至300μg/ ml。靈敏度：2.5 µg / ml
• 以鼠尾膠原蛋白為標準
• 易用性：相當于ELISA
• 室溫保存

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各種膠原的定量測定

•與物種無關

•570 nm下的比色讀出

•快速簡便

•動態范圍廣

•基于羥脯氨酸的分析

•獨立于提取方法

•無需特殊設備！

分析規格

動態范圍：6-300微克/毫升

靈敏度：2.5微克/毫升

樣品體積：50-500微升

格式：96孔板

用途：非常廣泛的應用：條件培養基

細胞/細胞提取物組織/組織提取物物種無關膠原類型無關

盒子里有什么？

包括標準、緩沖器和板。水解管，微量板，膠原蛋白標準品，緩沖液，檢測試劑，板封。不包括鹽酸。

其他所需材料

需要但不提供以下材料和設備：

•12M和6M HCl用于樣品水解

•4M HCl用于樣品和標準稀釋

•單通道和/或多通道移液管

•Eppendorf離心機

•恒溫箱（或溫度計或校準烤箱），用于在95攝氏度（不高于！）

•在60℃下加熱的培養箱

•可在540至580納米之間測量波長的微板閱讀器，優選570納米。

•微孔板振動篩

•聚丙烯、聚乙烯或玻璃管（不含聚苯乙烯）

定量測量

儲存條件

未打開的工具包：

在黑暗中室溫（RT）下儲存。不要使用超過套件有效期的套件組件。

打開的試劑盒/重組試劑：

打開的膠原蛋白標準品和分析緩沖液應在4℃下避光保存。其他打開的試劑應在室溫下避光保存，并至少穩定1個月。重組檢測試劑（A+B）應在重組當天使用。

預防措施

該試劑盒含有正丙醇、高氯酸、乙酸和二甲基亞砜。請參閱相關的MSDS:www.quickzyme。。ｃｏｍ/products/total-collagenassay。在2019年1月4日樣品水解和使用試劑盒時，在總膠原蛋白分析期間佩戴眼睛、手、臉和衣物保護裝置。在通風柜中進行分析。

臨界參數

•此類分析可顯示基質效應：樣品中影響信號的干擾因素。通過稀釋水解液可以避免這種影響。如果使用樣品類型，應測試各種稀釋液，直到獲得A570與稀釋液的線性。應用說明中給出了幾種小鼠組織的建議稀釋液（見我們網站上的產品頁）。如果對于您的特定樣品類型，為避免基質效應所需的稀釋導致A570值非常低，我們建議使用

Quickzyme敏感組織膠原試劑盒。

•水解發生在95攝氏度（不高于！）20小時。螺絲帽

管子應該用手緊緊地關上。如果管不嚴密，水解液將蒸發。

•在分析的后一步中，在60℃下顯色的培養時間為1小時。這是基于在烤箱中孵化。當在平板培養箱中進行培養時（培養箱和平板之間緊密接觸），縮短的培養時間（20-30分鐘）就足夠了。

•當將分析緩沖液添加到35μl（稀釋）水解液中時，會出現渾濁的外觀，在一分鐘內消失，不會影響分析。

•在低溫下，分析緩沖液可能含有一些晶體。這些可以通過加熱溶解。

在室溫下，試劑A可能變成凝膠或固體，在37℃加熱，渦旋將解決這個問題。

緩沖液/試劑制備

•分析緩沖液已準備好使用

•用于制備檢測試劑混合物2體積的檢測試劑A和3體積的檢測試劑B。

檢測試劑B和濃縮試劑A+B可能會腐蝕某些類型的塑料。對于這些溶液的移液，使用聚丙烯或聚乙烯移液管，或玻璃移液管。A+B溶液應在PP、PE或玻璃管中制成。不建議使用聚苯乙烯或PET。

試劑盒中提供的96孔板對分析中存在的稀釋A+B溶液具有抗性。檢測試劑B和A+B混合物具有腐蝕性，應小心處理。在通風柜中工作，使用適當的眼睛和面部保護，并戴手套。

樣品制備（1）

-細胞提取物

將細胞提取物（50–250μl）轉移到螺旋蓋管中，并用12M HCl（終濃度6M HCl）以1:1（v/v）稀釋。建議至少使用50μl樣品和50μl 12M HCl。在放入烤箱之前，請將管子關緊。另請參見上面的關鍵參數。

-組織

a.組織勻漿

組織勻漿的處理與上述條件培養基和細胞提取物的處理類似。

b.組織樣本

對組織樣品（濕的或干的）進行稱重，并將其轉移到螺旋蓋管中。所需的組織數量高度依賴于組織中的膠原蛋白水平。作為指示，根據組織的類型和數量，添加6M HCl以獲得50-300 mg組織/ml。建議小體積為100μl。

樣品制備（2）

管子必須非常緊密地閉合（從上面可以很清楚地看到橡膠圈），并在95℃下在校準的烤箱或熱塊中孵育20小時（不要在更高的溫度下孵育）。孵育后，將試管冷卻至室溫。在達到室溫之前不要打開管子。試管在eppendorf離心機中以13000 x g離心10分鐘。上清液用于進一步分析。由于脂肪和碳水化合物的降解而產生的棕色或黑色顆粒可能存在，通過離心很難*去除。顆粒的數量取決于樣品。轉移上清液時盡量避免用移液管移取顆粒。除了擋住光路之外，這些微粒不會干擾分析。

首先用半水稀釋水解樣品：1體積樣品+0.5體積水（例如200微升水解物+100微升水）。樣品現在在4M HCl中。可能需要的所有進一步稀釋（見“關鍵參數”中的備注）應使用4M HCl進行。試驗中使用35μl稀釋水解樣品進行分析。

標準制備

膠原蛋白標準品以1200μg/ml的儲備量在0.02m醋酸中提供。

對于標準線，將本標準的125μl轉移到螺旋蓋管中，并與等量（125μl）的12M HCl（6M HCl中的終濃度為600μg/ml）混合。管子非常緊密地閉合（橡膠圈應清晰可見），并在95攝氏度（不高于）下孵育20小時。在經過校準的烤箱或溫度計中。孵育后，將試管冷卻至室溫，并在13000 x g的eppendorf離心機中離心10分鐘。

上清液用于進一步分析。將8個Eppendorf管標記為S1-S8。s1至s7為水解料的稀釋液，s8為空白。用水和4M HCl進行首輪稀釋，以調整至4M HCl濃度。根據以下方案，在4M HCl中進行進一步稀釋。結果得到如下標準線：300μg/ml（s1）；200μg/ml（s2）；100μg/ml（s3）；50μg/ml（s4）；25μg/ml（s5）；12.5μg/ml（s6）；6.25μg/ml（s7）；0μg/ml（s8）。稀釋后將所有標準品充分混合。每種標準品35μl用于分析

膠原蛋白標準線樣品制備的移液方案

分析程序

建議對所有樣品和標準品進行分析，一式兩份

一。按照“樣品制備”中的說明制備樣品。

2.按照“標準制備”中的說明制備膠原蛋白標準品。

三。用移液管將35微升標準溶液移到分析微孔板的適當孔中。

四。用移液管將35μl稀釋的水解未知樣品（在4M HCl中）移到適當的孔中。

5個。每孔加入75μl試液，混勻。

6.用一個封閉的膠粘板封條蓋住板，在室溫下孵育20分鐘，同時搖動板。

7。通過檢測試劑A和B2:3（RESP 30μL＋45 L L/阱）混合，制備一套足以檢測待測威爾斯（75μL/阱）的試劑。

8。小心地拆下板密封件

9。每口井加入75μl檢測試劑。

10。用封閉的粘合板密封件蓋住板。

11。搖動盤子使之充分混合。在60°C的烘箱中培養60分鐘（不要使用更高或更低的溫度）。

12。把盤子放在冰上冷卻5分鐘至室溫

13。混合板并小心地拆下板密封件

14。清潔板底部，在570 nm（可接受540-580 nm）下讀取板并進行數據分析。

數據分析

有幾種方法可用于計算分析樣品中的膠原蛋白濃度。建議使用回歸曲線擬合程序的軟件包處理數據。如果不可用，可以手動計算膠原蛋白濃度，如下所示。

-平均每個標準品或樣品的重復讀數，并從所有讀數中減去平均空白。

-通過繪制Y軸上的每個標準的A570（減去空白）與XXAX（0 - 3.13 - 6.25 - 12.5 - 25 - 50 - 100 - 200 - 300μg膠原蛋白/ml水解物）上的膠原含量的標準曲線。通過圖形上的點繪制宜擬合線性化曲線。使用此標準曲線將試驗樣品的A570值轉換為μg/ml膠原。這就得到了水解樣品中的膠原蛋白濃度。如果水解后包括稀釋步驟，則濃度應乘以2019年1月8日的稀釋總膠原蛋白含量因子，得出水解樣品中的膠原蛋白濃度。根據樣品制備，可以計算原始樣品中的膠原蛋白量。

典型數據

所示數據曲線僅供演示。準確的a570值在每個實驗中可能略有不同。

典型的膠原蛋白標準曲線

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